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    {
        "id": 1,
        "chunk": "分  类  号：R318.08  \n研究生学号：2020741014  \n\n单位代码：10183密    级：公开",
        "category": " References"
    },
    {
        "id": 2,
        "chunk": "# 吉 林 大 学博士学位论文  \n\n局部递送雷帕霉素通过调控骨质疏松微环境促进 3D 打印微   \n孔假体界面骨整合的机制研究   \nStudy on the mechanism of local rapamycin delivery to   \npromote the osseointegration of 3D printed microporous   \nprosthetic interface by regulating the osteoporotic   \nmicroenvironment  \n\n作者姓名：李祖浩专    业：外科学研究方向：骨组织工程指导教师：王金成 教授培养单位：白求恩第二临床医学院  \n\n2023 年 5 月  \n\n局部递送雷帕霉素通过调控骨质疏松微环境促进 3D 打印微   \n孔假体界面骨整合的机制研究   \nStudy on the mechanism of local rapamycin delivery to   \npromote the osseointegration of 3D printed microporous   \nprosthetic interface by regulating the osteoporotic   \nmicroenvironment  \n\n作者姓名：李祖浩专业名称：外科学指导教师：王金成 教授学位类别：医学博士  \n\n论文答辩日期： 2023 年  5 月 26 日授予学位日期： 年    月    日  \n\n答辩委员会组成：  \n\n姓名 职称 工作单位  \n主席 李春义 教授 吉林农业大学  \n委员 丁建勋 研究员 中国科学院长春应用化学研究所刘钦毅 教授 吉林大学黄岚峰 副教授 吉林大学赵昕 副教授 吉林大学",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 3,
        "chunk": "# 中文摘要",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 4,
        "chunk": "# 局部递送雷帕霉素通过调控骨质疏松微环境促进 3D 打印微孔假体",
        "category": " Introduction"
    },
    {
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        "chunk": "# 界面骨整合的机制研究  \n\n骨整合指假体植入后假体界面与宿主骨组织之间形成的牢固连接，优良的骨整合是实现假体植入后长期稳定、延长假体使用寿命的关键因素。然而，临床上接受关节置换手术的患者多数为老年患者，常伴有骨质疏松，在假体植入后由于局部骨质不良、骨再生能力不佳，造成骨整合效果不理想，从而导致术后假体松动、移位和假体周围骨折等并发症高发。为提升骨整合效率，通过新兴的 3D 打印技术制备的个性化假体，在宏观上与植入位置的骨缺损高度匹配，在微观上可控的微孔结构提供初始稳定性、降低弹性模量、诱导骨长入与骨整合。然而，临床上广泛使用的3D 打印钛合金假体仍具有一定的生物惰性，在骨质疏松状态下的骨整合效率还有待进一步提高。目前有研究表明，骨质疏松状态下的骨再生和骨整合能力不足，可能是部分由于骨质疏松源性骨髓间充质干细胞（Osteoporosisderived bone marrow mesechymal stem cell, OP-BMSCs）低下的自噬能力导致细胞活性和增殖能力下降，成骨分化不足，趋向于成脂分化而造成。因此，在利于骨长入的3D 打印微孔假体界面负载激活 OP-BMSCs 自噬活性的药物，是恢复 OP-BMSCs 细胞活性和功能、促进假体界面骨整合的潜在策略。  \n\n针对上述问题，本研究拟设计自噬激活剂——雷帕霉素的两种递送策略来加强3D 打印假体界面的骨整合效果，具体方法如下：  \n\n（1）研究体系一：经皮超声介导雷帕霉素递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合：$\\textcircled{1}$ ． $\\mathrm{Ti_{6}A l_{4}V}$ 粉末为原料，利用 3D 打印电子束熔融技术成功制备了孔径为 800$\\upmu\\mathrm{m}$ ，孔隙率约为 $70\\%$ 的钛合金微孔假体，并对获得支架的表面形貌和力学性能进行分析。$\\textcircled{2}$ ．通过双侧卵巢切除术法制备骨质疏松兔子模型，提取和培养 BMSCs，使用流式细胞学对 BMSCs 典型的细胞表面抗原表达特点（CD45、CD90、CD105）进行分析以及成骨、成软骨和成脂三向分化能力进行鉴定。  \n\n$\\textcircled{3}$ ．首先通过体外检测超声介导雷帕霉素递送药物浓度与作用时间的关系，使用FITC-雷帕霉素体内递送，通过对皮肤、肌肉和骨的组织学观察确定在超声电导仪的频率为 $30\\mathrm{kHz}$ ，强度为 $45\\mathrm{W}/\\mathrm{cm}^{2}$ ，时间为 $10\\mathrm{min}$ 时超声介导雷帕霉素递送的安全性和有效性；随后通过 Western Blot 检测细胞中自噬关键蛋白 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的表达水平，Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞以及透射电子显微镜观察细胞内自噬泡形成情况，综合评估超声递送雷帕霉素对 OP-BMSCs 自噬水平的影响。  \n$\\textcircled{4}$ ．探究超声介导雷帕霉素递送对 OP-BMSCs 的功能调节，主要包括 CCK-8 法检测细胞增殖，Calcein-AM/PI 细胞活死染色分析细胞活性，鬼笔环肽染色观察细胞骨架，细胞划痕实验和 Transwell 实验检查细胞迁移能力，茜素红染色、RT-qPCR 和免疫荧光染色探究细胞成骨分化情况，油红 O 染色分析细胞成脂肪分化能力。  \n$\\textcircled{5}$ ．植入 3D 打印微孔假体至兔左侧股骨远端外侧髁，观察超声介导雷帕霉素递送促进骨质疏松状态下假体界面骨整合，主要包括 Micro-CT、硬组织切片和力学测试评估界面骨整合与周围骨质情况，界面周围骨质 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的蛋白水平检测评估自噬变化，界面周围骨质 RT-qPCR 和免疫荧光染色观察成骨相关标记物的表达。  \n（2）研究体系二：功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合  \n$\\textcircled{1}$ ．通过交联 N-羧乙基壳聚糖（CEC)、纳米银线（AgNW）、聚乙烯醇（PVA）、琼脂糖和甘油合成 CEC-PVA-AgNW 水凝胶，并表征水凝胶的流变学特征、力学性质、微观形貌、降解、生物相容性等理化性质。  \n$\\textcircled{2}$ ．制备3D 打印微孔假体，并将负载雷帕霉素的水凝胶与微孔假体复合构建 3D打印生物活性界面；评估 3D 打印生物活性界面的药物释放曲线以及对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌性能。$\\textcircled{3}$ ．通过 Western Blot 检测细胞中自噬关键蛋白 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的表达水平以及 Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞，评估 3D 打印生物活性界面对OP-BMSCs 自噬的影响。  \n$\\textcircled{4}$ ．探究3D 打印生物活性界面对 OP-BMSCs 的功能调节，主要包括 CCK-8 法检测细胞增殖，Calcein-AM/PI 细胞活死染色分析细胞活性，鬼笔环肽染色观察细胞骨架，茜素红染色和 RT-qPCR 探究细胞成骨分化情况，油红 O 染色分析细胞成脂肪分化能力。  \n$\\textcircled{5}$ ．将3D 打印生物活性假体界面植入兔左侧股骨远端外侧髁，观察其在骨质疏松状态下的骨整合情况，主要包括 Micro-CT 评估骨长入，硬组织切片评估骨整合效果，力学测试评估界面骨整合与周围骨质情况，界面周围骨质 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62 的蛋白水平检测评估自噬变化，界面周围骨质 RT-qPCR 和免疫荧光染色观察成骨相关标记物的表达。  \n$\\textcircled{6}$ ．3D 打印生物活性界面植入含有 S. aureus 和 MRSA 的股骨远端骨缺损中，评估在感染状态下假体界面的骨整合，包括血液学检查评估全身感染状态，影像学、硬切片组织学和力学测试评估假体界面骨整合效果。  \n\n通过这两个体系研究发现，无论是经皮超声介导雷帕霉素递送还是功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送，都可以通过激活 OP-BMSCs 自噬活性来提高细胞活性和成骨分化能力，同时抑制成脂分化，从而促进3D 打印微孔假体界面在骨质疏松状态下的骨整合。此外，功能化水凝胶中由于AgNW 的引入赋予了 3D打印生物活性界面独特的抗菌性能，可以有效的预防假体周围感染。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 6,
        "chunk": "# 关键词：  \n\n骨质疏松，3D 打印，水凝胶，骨整合，自噬",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 7,
        "chunk": "# Abstract",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 8,
        "chunk": "# Study on the mechanism of local rapamycin delivery to promote the osseointegration of 3D printed microporous prosthetic interface by regulating the osteoporotic microenvironment  \n\nOsteointegration refers to the firm connection between the prosthesis interface and the host bone tissue after the prosthesis is implanted. Excellent osteointegration is the key factor to achieve long-term stability and prolong the service life of the prosthesis. However, most of the patients receiving joint replacement surgery in clinic are elderly patients, often accompanied by osteoporosis. After the prosthesis is implanted, the osteointegration is not ideal due to local bone recession and poor bone regeneration ability, which leads to a high incidence of complications such as prosthesis loosening, displacement and periprosthetic fractures. In order to improve the osteointegration, the personalized prosthesis prepared by the emerging 3D printing technology is highly matched with the bone defect at the implantation site in the macro, and the micro controllable microporous structure provides initial stability, reduces the elastic modulus, and induces bone ingrowth and bone integration. However, 3D printed titanium alloy prosthesis, which is widely used in clinical practice, still has a certain degree of biological inertia, and the osteointegration efficiency under osteoporosis still needs to be improved. At present, some studies have shown that the insufficient ability of bone regeneration and osteointegration in osteoporosis may be partly due to the low autophagy level of osteoporotic derived bone marrow mesenchymal stem cells (OPBMSCs), which leads to low cell viability and proliferation, insufficient osteogenic differentiation and preferable adipogenic differentiation. Therefore, loading drugs that activate the autophagic activity of OP-BMSCs at the 3D printed microporous prosthesis interface which is conducive to bone growth is a potential strategy to restore the activity and function of OP-BMSCs and promote osseointegration. In view of the above problems, this study intends to design two delivery strategies of autophagy activator (rapamycin) to enhance the osseointegration of 3D printed prosthesis interface. The specific strategies are as follows:  \n\n(1) Research system I: Percutaneous ultrasound mediated rapamycin delivery promotes osseointegration at the prosthesis interface under osteoporosis by activating autophagy and regulating the osteogenic microenvironment.  \n\n$\\textcircled{1}$ .Using Ti6Al4V powder as raw material, we have successfully prepared 3D printed titanium alloy microporous prosthesis with the pore diameter was about $800~{\\upmu\\mathrm{m}}$ and porosity was about $70\\%$ . And then, the surface morphology and mechanical properties of the obtained scaffold were analyzed.  \n\n$\\textcircled{2}$ . The osteoporotic rabbit model was prepared by bilateral ovariectomy, and then BMSCs were extracted and cultured, and the typical cell surface antigen expression (CD45, CD90, CD105) of BMSCs were identified by flow cytometry, and the triadic differentiation ability of osteogenesis, chondrogenesis and adipogenesis was analyzed. $\\textcircled{3}$ . First, the relationship between the concentration of rapamycin by ultrasound mediated delivery and the action time was detected in vitro, and FITC-rapamycin was used for delivery in vivo, and the skin, muscle and bone tissues were observed. Thus, the safety and efficient parameters of ultrasound conductance instrument to deliver rapamycin were determined, namely the frequency was $30~\\mathrm{kHz}$ , the intensity was $45\\mathrm{W}/\\mathrm{cm}^{2}$ , and the time was 10 minutes. Then Western Blot was applied to evaluate the expression of the key autophagic proteins (mTOR, LC3 Ⅱ/Ⅰ and P62), Ad-mCherryGFP-LC3B double fluorescent adenovirus infection cells, and transmission electron microscopy for observing the formation of autophagic vesicles in cells, thus comprehensively evaluating the impact of ultrasound mediated rapamycin delivery on the autophagic level of OP-BMSCs.  \n\n$\\textcircled{4}$ . Studies on the cell functions of OP-BMSCs regulated by ultrasound mediated rapamycin delivery, mainly including CCK-8 assay to test cell proliferation, Calcein AM/PI staining to analyze cell activity, phalloidin staining to observe the cytoskeleton, cell scratch test and Transwell test to check the cell migration ability, alizarin red staining, RT-qPCR and immunofluorescence staining to explore the osteoblastic differentiation of OP-BMSCs, and Oil Red O staining to detect the adipogenic differentiation of OP-BMSCs.  \n\n$\\textcircled{5}$ The 3D printed microporous prosthesis was implanted into the lateral condyle of the left distal femur of rabbits. A series of tests were used to observe the ultrasound mediated rapamycin delivery promoting osseointegration of the prosthesis interface in osteoporosis, mainly including Micro-CT, hard tissue slice, and mechanical test evaluated the osseointegration at the interface and the surrounding bone condition; VI  \n\ndetection of protein level of mTOR, LC3 II/I and P62  in the bone tissue assessed autophagic changes around the interface; the expression of osteogenic markers was observed by RT-qPCR and immunofluorescence staining in the bone around the interface.  \n\n(2) Research system II: Functional hydrogel mediated local delivery of rapamycin promotes osseointegration at the prosthesis interface under osteoporosis by activating autophagy and regulating the osteogenic microenvironment.   \n$\\textcircled{1}$ . CEC-PVA-AgNW hydrogels were synthesized by cross-linking N-carboxyethyl chitosan (CEC), silver nanowires (AgNW), polyvinyl alcohol (PVA), agarose and glycerin, and then the characteristics of rheological festures, mechanical properties, microscopic morphology, degradation, biocompatibility, and other physical and chemical properties of the hydrogels were detected.   \n$\\textcircled{2}$ . 3D printed microporous prosthesis was prepared, and the 3D printed bioactive interface was constructed by compositing the rapamycin loaded hydrogel with microporous prosthesis. The drug release curve of 3D printed bioactive interface and the antibacterial performance against S. aureus and MRSA were evaluated.   \n$\\textcircled{3}$ . The expression levels of key proteins of autophagy (mTOR, LC3 Ⅱ/Ⅰ and P62) were evaluated by Western Blot, and Ad mCherry GFP-LC3B double fluorescent adenovirus infection cells were used to evaluate the regulation of 3D printed bioactive interface on autophagy of OP-BMSCs.   \n$\\textcircled{4}$ . Studies on the cell functions of OP-BMSCs regulated by 3D printed bioactive interface, mainly including CCK-8 assay to test cell proliferation, Calcein AM/PI staining to analyze cell activity, phalloidin staining to observe the cytoskeleton, alizarin red staining and RT-qPCR to explore the osteoblastic differentiation of OP-BMSCs, and Oil Red O staining to detect the adipogenic differentiation of OP-BMSCs. $\\textcircled{5}$ . The 3D printed bioactive prosthesis interface was implanted into the lateral condyle of the left distal femur of rabbits. A series of tests were used to observe the 3D printed bioactive prosthesis interface promoting osseointegration in osteoporosis, mainly including Micro-CT, hard tissue slice, and mechanical test evaluated the osseointegration at the interface and the surrounding bone condition; detection of protein level of mTOR, LC3 II/I and P62 in the bone tissue assessed autophagic changes around the interface; the expression of osteogenic markers was observed by RT-qPCR and immunofluorescence staining in the bone around the interface.  \n\n$\\textcircled{6}$ . 3D printed bioactive interface was implanted into the distal femoral bone defects infected with S. aureus and MRSA, to evaluate the bone integration of the prosthesis interface under infection, including hematological examination to evaluate the status of systemic infection, and imaging, hard section histology and mechanical testing to evaluate the bone integration effect of the prosthesis interface.  \n\nThrough the studies of these two systems, it was found that both percutaneous ultrasound mediated rapamycin delivery and functional hydrogel mediated local delivery of rapamycin could improve the cell activity and osteogenic differentiation capacities of OP-BMSCs while inhibiting adipogenic differentiation by activating the autophagic activity, thereby promoting the bone integration of 3D printed microporous prosthesis interface in osteoporosis. In addition, the introduction of AgNW into functional hydrogel endows 3D printed bioactive interface with unique antibacterial performance, which can effectively prevent infection around the prosthesis.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 9,
        "chunk": "# Keywords:  \n\nOsteoporosis, 3D printing, Hydrogel, Osteointegration, Autophagy",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 10,
        "chunk": "# 目  录  \n\n第 1 章 绪论.  \n1.1 骨质疏松性骨整合微环境  \n1.1.1 骨整合的生理过程 . .1  \n1.1.2 骨质疏松性骨微环境. 3  \n1.2 骨质疏松性骨整合的假体设计 .12  \n1.2.1 假体主体材料 . ...12  \n1.2.2 3D 打印微孔假体 ...14  \n1.2.3 假体表面涂层与改性 . ..17  \n1.2.4 局部递送活性物质 . ...19  \n1.3 局部活性物质递送策略. .22  \n1.3.1 体内局部递送系统 . .22  \n1.3.2 体外经皮递送系统 . .25  \n1.4 选题目的与主要研究内容 . .27  \n第 2 章 经皮超声介导雷帕霉素递送通过激活自噬和调控成骨微环境  \n促进骨质疏松状态下假体界面骨整合 . .29  \n2.1 3D 打印微孔假体界面的制备与表征.. ..30  \n2.1.1 实验仪器与材料 . ..30  \n2.1.2 实验方法 . ..30  \n2.1.3 实验结果 . ..31  \n2.1.4 讨论 . ...32  \n2.1.5 小结 ..33  \n2.2 骨质疏松家兔模型建立及 BMSCs 提取、培养和鉴定 .. ..33  \n2.2.1 实验仪器与材料 . ...33  \n2.2.2 实验方法 ..35  \n2.2.3 实验结果 ..37  \n2.2.4 讨论 .. ...40  \n2.2.5 小结 ..40  \n2.3 超声介导雷帕霉素递送激活 OP-BMSCs 自噬 . ..41  \n2.3.1 实验仪器与材料 . ...41  \n2.3.2 实验方法 . ..42  \n2.3.3 实验结果 ...45  \n2.3.4 讨论 .. ..47  \n2.3.5 小结 ..49  \n2.4 超声介导雷帕霉素递送调节 OP-BMSCs 功能 .49  \n2.4.1 实验仪器与材料 .49  \n2.4.2 实验方法 . ...51  \n2.4.3 结果 . ....55  \n2.4.4 讨论 ... ...59  \n2.4.5 小结 .60  \n2.5 超声介导雷帕霉素递送促进骨质疏松状态下假体界面骨整合 61  \n2.5.1 实验仪器与材料 ..61  \n2.5.2 实验方法 ..62  \n2.5.3 结果 . ...67  \n2.5.4 讨论 . .72  \n2.5.5 小结 . ...76  \n2.6 本章总结 76  \n第 3 章 功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送通过激活自噬和调控  \n成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合 . 77  \n3.1 水凝胶的制备与表征 .. ..78  \n3.1.1 实验仪器与材料 . ...78  \n3.1.2 实验方法 ..79  \n3.1.3 结果 .. ...81  \n3.1.4 讨论 . ..84  \n3.1.5 小结 . ....85  \n3.2 3D 打印生物活性界面制备、表征与抗菌性分析 . .....85  \n3.2.1 实验仪器与材料 .... ....85  \n3.2.2 实验方法 ..87  \n3.2.3 结果 .. ...88  \n3.2.4 讨论 . ....90  \n3.2.5 小结 ..91  \n3.3 3D 打印生物活性界面激活 OP-BMSCs 自噬 . ...91  \n3.3.1 实验仪器与材料 ..91  \n3.3.2 实验方法 . ...92  \n3.3.3 实验结果 ....93  \n3.3.4 讨论 ... ....94  \n3.3.5 小结 ..95  \n3.4 3D 打印生物活性界面调节 OP-BMSCs 功能 . ...95  \n3.4.1 实验仪器与材料 ...95  \n3.4.2 实验方法 ..97  \n3.4.3 结果 . ...99  \n3.4.4 讨论 . .101  \n3.4.5 小结 . .102  \n\n3.5 3D 打印生物活性界面促进骨质疏松状态下假体界面骨整合 . 103  \n\n3.5.1 实验仪器与材料. .103  \n3.5.2 实验方法 . .104  \n3.5.3 结果 .105  \n3.5.4 讨论 . 111  \n3.5.5 小结 .113  \n3.6 3D 打印生物活性界面促进感染状态下假体界面骨整合 .113  \n3.6.1 实验仪器与材料 .113  \n3.6.2 实验方法 .114  \n3.6.3 结果 . 115  \n3.6.4 讨论 . .117  \n3.7 本章总结. 118  \n第4 章 全文结论与展望 .121  \n4.1 全文结论. .121  \n4.2 本论文关键创新点. .121  \n4.3 研究展望 .122  \n参考文献 . 123",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 11,
        "chunk": "# 英文缩略词表  \n\n<html><body><table><tr><td>英文缩写</td><td>英文全称</td><td>中文全称</td></tr><tr><td>MSCs</td><td>Mesenchymal stem cells</td><td>间充质干细胞</td></tr><tr><td></td><td>OP-BMSCs Osteoporosis derived-bone marrow 骨质疏松状态下的骨髓间</td><td></td></tr><tr><td></td><td>mesenchymal stem cells</td><td>质干细胞</td></tr><tr><td>mTOR</td><td> Mechanistic Target of Rapamycin</td><td>机械性雷帕霉素的靶标</td></tr><tr><td>ROS</td><td>Reactive oxygen species</td><td>活性氧</td></tr><tr><td>BMP-2</td><td>Bone morphogenetic protein-2</td><td>骨形态发生蛋白-2</td></tr><tr><td>TGF-β PDGF-BB</td><td>Transforming growth factor-β</td><td>转化生长因子-β</td></tr><tr><td>TNF-α</td><td>Platelet-derived growth factor BB</td><td>血小板衍生生长因子BB</td></tr><tr><td>IL-1</td><td>Tumor necrosis factor-α</td><td>肿瘤坏死因子-α</td></tr><tr><td>SLS</td><td>Interleukin-1</td><td>白介素-1</td></tr><tr><td>SLM</td><td>Selective laser sintering</td><td>选区激光烧结</td></tr><tr><td></td><td>Selective laser melting</td><td>选区激光熔融</td></tr><tr><td>EBM p-OGP</td><td>Electron beam melting, Phosphorylated　osteogenic　growth 磷酸化成骨生长肽</td><td>电子束熔融</td></tr><tr><td></td><td> peptide</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>Vascular endothelial growth factor</td><td>血管内皮细胞生长因子</td></tr><tr><td>OPG</td><td>Osteoprotegerin</td><td>骨保护素</td></tr><tr><td>PTH</td><td>1-34 human parathyroid hormone</td><td>1-34人甲状旁腺激素</td></tr><tr><td>OVX</td><td>Ovariectomy</td><td>卵巢切除术</td></tr><tr><td>ELISA</td><td>Enzyme-linked immunosorbent assay</td><td>酶联免疫吸附试验</td></tr><tr><td>BMD</td><td>Bone mineral density</td><td>骨密度</td></tr><tr><td>MAR</td><td>Mineral apposition rate</td><td>矿物质沉积率</td></tr><tr><td>MS/BS</td><td>Mineralizing surface per bone surface 矿化表面/骨表面</td><td></td></tr><tr><td>BFR/BS</td><td>Bone formation rate per bone surface</td><td>骨形成率/骨表面</td></tr><tr><td>CEC</td><td>N-carboxyethyl chitosan</td><td>N-羧乙基壳聚糖</td></tr><tr><td>AgNW</td><td>Silver Nanowires</td><td>纳米银线</td></tr><tr><td>PVA</td><td>Polyvinyl alcohol</td><td>聚乙烯醇</td></tr></table></body></html>",
        "category": " References"
    },
    {
        "id": 12,
        "chunk": "# 第 1 章 绪论",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 13,
        "chunk": "# 1.1 骨质疏松性骨整合微环境  \n\n随着人口老龄化的进展，骨关节炎的患病率逐年增加，且与骨质疏松的发病率成正相关。根据全球疾病负担显示膝关节和髋关节骨关节炎的全球年龄标准化发病率分别为 $3.8\\%$ 和 $0.85\\%$ [1]。从具体数字来说，目前全球已有超过 3 亿骨关节炎患者，而我国的骨关节炎流行病例居全球首位，40 岁以上原发性骨关节炎患者总体患病率高达 $46.3\\%^{[2]}$ 。全关节置换术已成为降低疼痛和恢复关节功能的有效解决方案。然而，假体植入后的无菌性松动、移位，假体周围骨折以及感染等导致的失败以及在这些情况下所需的翻修手术仍然是一个重大的临床挑战。  \n\n假体植入后的长期稳定性是骨关节外科手术成功的关键之一。骨整合是骨与内植物之间的功能结构连接，被认为是非骨水泥假体固定和整合的关键过程[3]。骨整合是宿主骨与植入物界面之间由新生骨组织牢固连接，假体与骨位置关系稳定，不发生相对微动、位移。骨整合受多种因素的影响，主要包括植入物的性能和受体疾病状态等。随着人口老龄化的加深，接受关节置换的患者合并骨质疏松症的病例已成为常规，这一比例可达 $31\\%$ ，甚至更高 [4, 5]。骨质疏松症患者在假体植入后骨整合能力不足，假体无菌性松动、移位和假体周围骨折等并发症高是困扰关节外科的难题 [6]。因此，深入理解骨整合的机制、阐明骨质疏松骨整合受限的原因、设计利于骨质疏松患者骨整合的假体是关节外科亟需解决的重点问题之一。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 14,
        "chunk": "# 1.1.1 骨整合的生理过程  \n\n骨整合是指宿主骨和人工植入物表面之间形成有序化的结构连接和功能联系，是影响内植物植入后假体寿命的关键性事件。假体植入后界面骨整合过程与骨损伤后的愈合过程具有一定的相似性，它们都涉及骨质破坏、免疫细胞募集、血管新生、骨基质沉积、骨化等阶段，但它们最大的区别在于连接结构的不同：骨愈合是骨与骨之间的连接，而骨整合是骨与异种假体界面材料的连接。骨整合是一个涉及一系列级联响应的动态过程，包括一系列的细胞和细胞外生物事件，其中植入物表面的特性起着重要作用。如图 1.1 所示，骨整合的过程可以根据假体界面周围发生的生物反应大致分为 5 个阶段 [7]。  \n\n（ⅰ）外伤、截骨导致的骨损伤、以及异体植入物置入体内后会迅速在局部产生炎症反应，导致各种蛋白质的释放，如生长因子和细胞因子，同时红细胞、血小板与植入物表面接触，启动外源性凝血过程，在植入物表面形成凝血块 [7, 8]。几分钟后，这些凝血块中释放的蛋白质和脂质将被植入物表面吸附，作为细胞迁移和增殖的信号 [9]。蛋白质的具体类型和粘附牢固度在很大程度上取决于植入物表面的特征，如形貌特征、粗糙度和亲水性等。随后，血小板促进纤维蛋白基质的形成，这些纤维蛋白基质是细胞迁移和附着的“桥梁”[10-12]。  \n\n（ⅱ）在假体植入后 2-3 天，巨噬细胞和中性粒细胞通过“桥梁”附着在植入物界面上，清除病原体和坏死组织，分解凝血块，为随后形成的新生血管腾出空间 [13, 14]。在第4 天之后 ，在植入物和宿主骨之间的间隙发生血管生成事件，非分化骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）聚集在血管结构周围。在一系列生长因子和细胞因子的影响下，MSCs 分化为成骨细胞，可产生细胞外基质并形成未成熟的编织骨 [15, 16]。然而，此时的 MSCs 也可以分化为成纤维细胞，这可能会刺激植入物表面形成纤维膜，并阻碍骨长入过程 [17, 18]。而 MSCs的这种不定向分化主要受假体表面性质和周围细胞通讯的影响 [19, 20]。  \n\n（ⅲ）在假体植入 1–2 周后编织骨形成持续发生。由于 MSCs 的运动由纤维蛋白桥引导，因此根据 MSCs 的粘附方式可分为两种类型的成骨作用，即接触成骨和距离成骨。接触成骨作用是指直接在植入物表面开始的成骨。另一方面，距离成骨作用出现在植入物周围的骨骼或组织，可以通过纤维蛋白桥迁移到植入物表面[21, 22]。Choi 等人证明，两种成骨过程相互作用，假体植入后的周围骨组织经历的远距离成骨可以传递诱导接触成骨的信号 [23]。  \n\n（ⅳ）在假体植入 2 周之后 ，骨-内植物间隙被新生的编织骨填充，骨整合的后续过程是骨沉积和重塑。在这一过程中，破骨细胞重新吸收新形成的骨，以消除微裂纹，优化板层骨的表面。破骨细胞建立了一个封闭区，并创建了各种微米级和纳米级包含生化信息的微观形貌，引导成骨细胞找到需要新骨形成的位置[24, 25]。  \n\n（ⅴ）破骨细胞和成骨细胞协调合作，将脆弱的临时编织骨逐渐转变为平行的纤维骨，然后转变为板层骨，这种动态过程持续存在达 1 年或更长时间。  \n\n假体植入后影响骨整合的因素是多方面的，这些因素通常可被分为两个方面：即骨-种植体界面周围的环境因素和种植体本身的设计。环境因素包括载荷条件、宿主骨特性、界面距离、局部血供、局部成骨细胞和破骨细胞浓度以及全身疾病（骨质疏松、糖尿病、类风湿性关节炎和吸烟等）[26-28]。另一方面，假体的性质，包括材料成分、表面涂层、拓扑结构、宏观和微观结构、粗糙度、孔径和孔隙率等因素也会极大地影响骨整合的效果 [29-31]。根据不同疾病状态的患者，设计优化的假体，对于促进假体界面骨整合，提高假体植入成功率和使用寿命是至关重要的。  \n\n![](images/fc8e7df10b948cd8414dc308e6252e69d00496b7b57e8032b317ff608e81ec9f.jpg)  \n\n图 1.1 植入物假体界面骨整合过程示意图。（ⅰ）血凝块和纤维蛋白基质的形成；（ⅱ）血管生成和编织骨形成；（ⅲ）距离成骨和接触成骨；（ⅳ）新生的编织骨骼填补了缺口，并进行了骨骼重塑；（ⅴ）编织骨骼转化为板层骨骼。Dc，分解的血凝块；M， 巨噬细胞；MSC，间充质干细胞；N，中性粒细胞；O， 骨细胞；Ob，成骨细胞；Oc，破骨细胞 [7]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 15,
        "chunk": "# 1.1.2 骨质疏松性骨微环境  \n\n骨质疏松是以全身骨量减少，骨组织的微观结构改变，易引起脆性骨折为特征的一种渐进性、全身性疾病 [32]。随着人口老龄化的进展，我国 40 岁以上人群中骨质疏松的患病率高达 $19.74\\%$ 至 $24.62\\%$ ，尤其是绝经后妇女和老年人具有更高的患病率，这与需要接受关节置换的骨关节炎的患者群有着极大的年龄重合[33, 34]。先前有研究显示，接受关节置换的患者中，高达 $50\\%$ 的患者合并有骨质疏松症，其中女性患者占 $53.4\\%$ ，男性患者占 $7\\%$ [35]。正常状态下，由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞导致的骨质吸收共同维持体内的骨代谢处于动态平衡状态。然而，当破骨细胞主导的骨吸收活性增强，而没有相应提高的骨形成活性，则会导致骨密度下降，甚至骨质疏松。绝经后妇女体内的雌激素水平因卵巢功能逐渐衰竭而下降，雌激素缺乏通过影响 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、单核细胞和一系列细胞因子水平，增加骨转换和导致骨代谢失衡。除了雌激素缺乏，骨质疏松状态下糖皮质激素含量增高、维生素 D 和活性因子水平低下也是造成包括自噬改变、氧化应激以及慢性炎症等特定病理性骨微环境的重要因素（如图 1.2）[36]。此外，表观遗传变化，如非编码 RNA 和 DNA 甲基化的变化，也可以减少成骨基因的表达 [37]。在骨质疏松状态下，成骨细胞介导的骨形成作用下降、破骨细胞主导的骨吸收活性过度活跃，造成体内成骨-破骨平衡失紊，造成骨质下降、骨量丢失和损伤后骨修复缓慢或不足。骨质疏松的这种骨微环境导致假体植入后内植物与宿主骨结合不牢固，较差的骨整合易导致假体无菌性松动、移位和假体周围骨折等术后并发症 [38-40]。研究表明，细胞功能极其依赖于周围的微环境（细胞外基质、体液成分等），相反，未能保持微环境的稳定性很可能导致细胞/组织的异常变化 [41]。因此，充分了解骨质疏松的疾病机理和假体界面周围局部的骨微环境，对于新型假体的设计和促进界面骨整合具有指导性意义。  \n\n![](images/7c0e56d542ef47029bf0b25167458a77e7e55dd44442da12dbfab0149dc993a3.jpg)  \n图 1.2 骨质疏松局部病理性骨微环境特征 [36]。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 16,
        "chunk": "# 1.1.2.1 自噬及其改变  \n\n自噬是指具有双层膜结构包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分所形成自噬小体，并随后可与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将其所包裹的内容物进行有序降解，以实现细胞本身的代谢需求和更新相应细胞器的过程 [42]。自噬是一种细胞内固有的自我防御和应激调控机制，通过自噬和溶酶体功能清除、消化和降解受损的细胞器、变性的蛋白以及核酸等，从而实现对细胞内物质的循环利用，并为衰老细胞修复和重塑提供必要的原料。自噬具有多种多样的生理功能，比如耐受饥饿、清除胞内异常折叠的蛋白以及受损的细胞器、促进细胞分化和机体发育、延长寿命、清除病原微生物等。自噬调节缺陷在许多疾病中起着核心作用，包括退行性病变、癌症、感染和代谢性疾病 [43]。  \n\n根据细胞内底物运送到溶酶体腔的方式，如图 1.3A 所示，哺乳动物的自噬分为的 3 种类型，即 $\\textcircled{1}$ 巨自噬（macro-autophagy）：胞质中的一些膜性结构通过扩展、包绕待降解物而形成自噬小体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解其包绕的内容物； $\\textcircled{2}$ 微自噬（micro-autophagy）：溶酶体的膜向内内陷直接包裹细胞内容物并在溶酶体内降解； $\\textcircled{3}$ 分 子 伴 侣 介 导 自 噬 （ chaper-one-mediatedautophagy）：细胞质内的蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，随后被溶酶体酶消化。平时所说的自噬通常指巨自噬。细胞受到自噬相关信号诱导后，在胞浆内可形成小的类似“脂质体样”的膜结构，然后不断扩张呈扁平状，似一个由2 层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称之为Phagophore，是自噬发生关键性铁证之一。随后，Phagophore 不断延伸，将胞浆中各种各样的成分揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭、球形的autophagosome，即“自噬体”。通过电镜观察到自噬体的形成是自噬发生的关键性铁证之二。通常，自噬体有两个关键特征：一是双层膜，二是内部含有胞浆成分。自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。随后自噬体通过与溶酶体融合后形成autolysosome，在这过程中自噬体的内膜被溶酶体酶降解，使得这两者原有的内容物融合为一体，自噬体中所封装的“货物”也随之被降解，这些降解产物包括氨基酸、脂肪酸等被运输到胞浆中以供细胞重新再利用，而剩余的残渣则被排出至胞外或滞留于胞浆中（如图1.3B）[44]。  \n\n![](images/947765bf2fd703efb6e1da61cc9b4fa7d0ee1d731ab6ab421352d603e0ab009c.jpg)  \n图1.3 （A）哺乳动物中三种类型细胞自噬示意图;（B）巨自噬的过程 [44]。  \n\n与年龄相关的自噬抑制或效率降低可能会导致老年人骨质丢失和骨质疏松。在骨质疏松状态下的骨髓间充质干细胞（ Osteoporosis derived-bone marrowmesenchymal stem cells, OP-BMSCs）自噬水平低下，可能是骨损伤后成骨能力不足的重要原因 [45]。Liu 等人确定自噬受体 Optineurin（OPTN）是决定 BMSCs 细胞命运的关键分子，其在老龄小鼠中的表达降低，老龄小鼠和 optn-/-小鼠出现骨质疏松性骨质流失，BMSCs 老化加剧，成骨减少，脂肪生成增加 [46]。此外，与衰老相关性骨质疏松的一个重要风险因素是维生素 D 不足。维生素 D3 可提高细胞质钙水平，CaMKKβ-AMPK 信号通路被激活，从而抑制 mTORC1 的活性，促进自噬 [47]。糖皮质激素水平升高是导致衰老的另一个因素，过量的糖皮质激素可诱导 BMSCs 凋亡，然而通过诱导自噬，糖皮质激素诱导的 BMSCs 凋亡可以被阻止 [36]。据报道，骨质疏松大鼠模型中成骨细胞的自噬水平也降低 [48]。成骨细胞特异性缺失FIP200（哺乳动物自噬的关键成分）的小鼠，由于成骨细胞终末分化缺陷和骨生成减少而发生骨质减少 [49]。Onal 等人在6 月龄的小鼠中有条件地敲除了骨细胞的自噬基因 Atg7，除了破骨细胞和成骨细胞数量下降、骨生成率下降和氧化应激增加外，他们还发现了骨量下降 [50]。这些变化也是衰老小鼠的特征，此外，自噬可以抑制氧化应激介导的成骨细胞凋亡 [51]。综上可知，骨质疏松局部骨微环境中低下的自噬水平是造成骨再生受限，假体界面骨整合不足的一个重要原因。  \n\n自噬可以通过多种信号途径进行调节，其中一个关键分子是机械性雷帕霉素的靶标（Mechanistic Target Of Rapamycin, mTOR），它可以感知细胞内外的各种信号变化，并调节自噬水平以响应外部环境的刺激。其中，mTOR 抑制剂——雷帕霉素作为经典的自噬诱导剂，可在上游激活隔离膜的形成，也称为 Phagophore，从而启动下游的自噬活动（如图 1.4）[43]。绝经后骨质疏松哺乳动物 BMSCs 的自噬水平降低，然而，雷帕霉素抑制关键靶点 mTOR 可以恢复自噬水平，增强OP-BMSCs 的增殖和成骨分化潜能，并改善体内的骨微结构 [45]。雷帕霉素作为经典的自噬诱导剂，可以激活细胞的自噬活性 [52, 53]。既往研究显示通过雷帕霉素来激活自噬，可部分改善骨质疏松状态下的成骨不良，增加骨量 [54, 55]。这些结果表明，自噬调节 BMSCs 的再生功能并控制骨质疏松症的发展，通过雷帕霉素激活自噬可能为增强骨质疏松症的骨整合提供有效的治疗策略。  \n\n![](images/e36d91860e9cd235ce19fec1556a98451f24ebd51a1e31a77b10dcd92c6b5c34.jpg)  \n图1.4 自噬核心机制的示意图模型 [43]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 17,
        "chunk": "# 1.1.2.2 氧化应激  \n\n与健康人群相比，骨质疏松症患者表现出更高的氧化应激水平。具体来说，在骨质疏松状态下，雌激素缺乏会上调活性氧（Reactive oxygen species, ROS）水平，如 $\\ensuremath{\\mathbf{O}}_{2}^{-}$ , $\\mathrm{H}_{2}\\mathrm{O}_{2}$ ，OH-，导致ROS 在骨髓微环境中快速积累。而骨髓微环境通过为骨相关细胞提供生化、物理和机械信号，是骨形成的主要场所 [56-58]。局部微环境中 ROS 水平的升高会抑制MSCs 的分化，严重阻碍植入物的早期骨整合，从而增加二次手术的风险。此外，氧化剂中间产物的过度积累将对机体的免疫和骨骼系统产生不利影响，加剧骨质流失并阻碍植入物的骨整合[59]。  \n\n此外，ROS 堆积也可影响局部免疫微环境。骨免疫调节已被广泛认为是骨再生的一个重要组成部分，因为它可以有效调节骨免疫环境，促进骨组织再生 [60,61]。研究表明，ROS 在炎症反应期间同时作为信号分子和效应分子发挥作用，导致免疫细胞向植入部位募集，从而干扰骨整合，并对周围组织造成损伤和纤维化[62, 63]。此外，由于巨噬细胞具有被刺激发育为破骨细胞的能力，与骨免疫调节密切相关，以及 M1/M2 极化的异质性，巨噬细胞吸引了大量关注 [64]。在成骨方面，M2 巨噬细胞可以显著刺激 MSCs/前体成骨细胞分化为成熟的成骨细胞并增强骨矿化，这部分归因于 M2 巨噬细胞分泌抗炎因子（如 IL-4、IL-10 等）和生长因子（如 BMP-2、TGF- $\\cdot\\upbeta$ 等）[65, 66]。在血管生成方面，M2 巨噬细胞分泌的因子，尤其是血小板衍生生长因子 BB（Platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB），可以有效促进新血管的形成，从而加速骨修复过程 [67]。此外，在预防骨溶解方面，M2 巨噬细胞产生的细胞因子（如 IL-4 和 IL-13）不仅可以抑制破骨细胞前体的分化，还可以抑制成熟破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收 [68]。因此，M2 巨噬细胞在促进成骨/血管生成和抑制骨溶解方面发挥着关键作用，这对于改善骨质疏松症患者的骨骼健康具有重要的理论和实践意义。然而，在骨质疏松状态下，ROS 堆积导致的氧化应激微环境中，巨噬细胞向 M2 极化受阻，转而更多的向M1 极化 [68]。M1 型巨噬细胞主要分泌促炎因子，具有很强的杀死微生物特性，在炎症早期承担着重要作用，但是过度的炎症持续也容易引起组织破坏。巨噬细胞过度的 M1 极化，导致 M1/M2 细胞类群比例失调，持续分泌肿瘤坏死因子- $\\mathbf{\\sigma}\\cdot\\mathbf{a}$ （Tumor necrosis factor- $\\mathbf{\\nabla}\\cdot\\mathbf{a}$ , TNF- $\\mathbf{\\nabla}\\cdot\\mathbf{a}$ ）、白介素-1（Interleukin-1, IL-1）和白介素-6（Interleukin-6, IL-6）等促炎因子 [69]。这种免疫失调的微环境导致骨髓内形成一个慢性、低度炎症的衰老状态，显著影响了骨质疏松状态下细胞成骨分化和骨形成 [70]。基于此，Chen 等人采用电化学阳极氧化方法进行表面改性， 开发了负载超低剂量银纳米粒子的 $\\mathrm{TiO}_{2}$ 纳米管（Ag@TiO2-NTs）作为抗氧化剂，通过清除活性氧，可以有效诱导巨噬细胞极化为 M2 表型，从而为调节骨免疫调节活性提供良好的微环境，并且通过抑制 PI3K/Akt、抑制下游效应器GLUT1 和激活自噬 [71]。  \n\n有研究表明，抑制 ROS 的过度积累可以显著增加成骨相关标志物的表达，增加骨量 [72, 73]。因此，针对内源性 ROS 堆积的负调控策略有望成为促进钛种植体界面的骨长入和骨整合的可行途径。表面抗氧化涂层制备被认为是赋予钛植入物优异抗氧化性能的最有前景的方法之一。先前的研究表明，在氧化应激条件下，钛植入物上的阳极氧化纳米材料具有优越的抗氧化能力，比未经处理的钛假体更有利于成骨 [74]。近年来，大量功能性聚合物涂层（例如丝素蛋白、原花青素等）被用于开发抗氧化钛植入物 [75, 76]。如图1.5 所示，为解决骨质疏松症下 ROS 的过度积累干扰钛植入物的生物活性及其早期骨整合，Shen 等人通过微弧氧化制备了一系列掺锶钛植入物。通过增加过氧化氢酶/超氧化物歧化酶活性和降低ROS 水平，高掺锶样品（ $\\mathrm{Sr}75\\%$ 和 $\\mathrm{{sr}100\\%}$ ）在诱导 MC3T3-E1 细胞成骨分化和  \n\nRAW264.7 细胞 M2 表型极化方面优于 $S r25\\%$ ，从而增强早期骨整合。此外，体外细胞共培养和体内研究的结果也表明，高掺锶样品（尤其是 $S_{\\mathrm{{r}100\\%}}$ ）在氧化应激微环境下对骨免疫调节具有积极作用。最终，对比结果表明高比例掺锶的微弧氧化涂层更有利于骨质疏松患者的骨再生与假体界面骨整合 [77]。  \n\n![](images/b0be32281f1ec4d8944eae7051ee2ac7c2ee977d0a2666cf4a4a577b1c540dd1.jpg)  \n\n图1.5 氧化应激条件下高掺锶钛假体促进早期骨整合的示意图。首先，释放的 ${\\mathrm{Sr}}^{2+}$ 通过增强过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性，消除了成骨细胞过多的内源性ROS，赋予了优越的成骨诱导和抗氧化特性；其次， $\\mathrm{Sr}^{2+}$ 通过抑制氧化应激和炎症水平来调节巨噬细胞的形态和过氧化氢酶/超氧化物歧化酶活性，从而促进巨噬细胞向 M2 极化；最后，M2 巨噬细胞大量表达成骨相关细胞因子，如 TGF-β1、BMP-2，可有效改善成骨 [77]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
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        "id": 18,
        "chunk": "# 1.1.2.3 慢性炎症  \n\n各种年龄相关疾病，包括骨质疏松和脆性骨折，较高的发病率常与慢性炎症相关 [78]。各种促炎信号作用于 MSCs 和破骨细胞前体，加速破骨细胞介导的骨吸收 [79]。老年人较高的血清炎症标记物水平预测了与年龄相关的骨丢失和骨吸收增加 [80]。免疫系统在老年骨质疏松症发病中的作用主要是由于受到雌激素缺乏和继发性甲状旁腺功能亢进的影响。绝经后妇女显著的雌激素缺乏除了直接影10  \n\n响骨细胞外，还间接导致慢性、低度炎症表型，即细胞因子表达改变和免疫细胞形态改变 [70]。根据研究，雌激素缺乏导致促炎细胞因子大量增加，包括 IL-1、IL-6、TNF- $\\mathbf{\\sigma}\\cdot\\mathbf{a}$ 、巨噬细胞集落刺激因子和前列腺素 E2 [81-83]。这些细胞因子大多数直接或间接作用于成骨细胞和破骨细胞，促进单核细胞向成熟破骨细胞分化，并调节破骨细胞功能。TNF- $\\mathbf{\\sigma}\\cdot\\mathbf{a}$ 可增加成骨细胞凋亡和 RANKL 的表达，这间接导致破骨细胞分化和活性的增加，并抑制破骨细胞凋亡，从而导致绝经后骨质疏松症患者的骨量丢失 [84]。Zha 等人发现，绝经后骨质疏松患者的 TNF- $\\mathbf{\\sigma}\\cdot\\mathbf{a}$ 水平高于非绝经女性，通过体外刺激 ${\\mathrm{NF}}{\\mathrm{-}}{\\mathrm{\\kappa}}\\mathrm{B}$ 和 PI3K/Akt 途径，TNF- $\\mathbf{\\sigma}\\cdot\\mathbf{a}$ 可协同增强 RANKL诱导的破骨细胞形成 [85]。  \n\n为解决骨质疏松症局部微环境中炎症因子过高这一问题，Li 等人设计了一种由纳米羟基磷灰石、白藜芦醇和壳聚糖构成的复合微球，通过局部缓释白藜芦醇以创造有利的局部微环境，从而改善成骨（如图 1.6）。具体来说，该微球具有抗炎活性，表现为在 RAW 264.7 细胞中促炎细胞因子 TNF- $\\mathbf{\\nabla}\\cdot\\mathbf{a}$ 、 $\\mathrm{IL}\\mathrm{-}1\\upbeta$ 和一氧化氮合成酶的表达呈白藜芦醇剂量依赖性降低。此外，复合微球有利于 BMSCs 在其表面粘附和增殖，并通过上调 Runx-2、ALP、Col-1 和 OCN 的表达和大量矿化而增强其成骨分化的能力。当植入骨质疏松大鼠股骨髁缺损处时，增强的软骨内成和骨再生表明，该复合微球更有利于受损的骨折愈合，可作为骨质疏松性骨缺损或骨折治疗的多功能填料 [86]。此外，Wang 等人通过微弧氧化和电化学沉积技术在钛种植体表面制备掺锶纳米结构，然后通过逐层自组装技术添加嵌入丝素蛋白基汉黄芩素纳米粒子的多层涂层。研究发现，该功能化植入物可以持续释放汉黄芩素和 $\\mathrm{Sr}^{2+}$ 超过 7 天和 21 天，可以显著抑制种植体周围炎性因子的表达，并有效促进假体界面的新骨形成，为开发促进骨质疏松性骨整合用途的功能性钛合金材料提供了一种简单有效的方法 [87]。  \n\n![](images/36e78133f8b283dadccb55985f328bf65badf1dc3f2e15b31ba072b90b9b0c81.jpg)  \n图1.6 （A）通过纳米羟基磷灰石（n-HA）、白藜芦醇（Res）和壳聚糖（CS）制备复合微球的示意图；（B）复合微球抑制促炎细胞因子 TNF- $\\mathbf{\\nabla}\\cdot\\mathbf{a}$ 和 IL-1β 的表达，呈白藜芦醇剂量依赖性；（C）Masson 三色染色观察复合微球对骨质疏松骨缺损的修复情况 [86]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 19,
        "chunk": "# 1.2 骨质疏松性骨整合的假体设计  \n\n研究表明，骨整合过程受多种因素的影响，这些因素通常可分为两个方面：即骨-种植体界面周围的环境因素和种植体本身的设计。自从认识到假体界面骨整合的重要性以来，骨科医生和材料学家已经制定了许多策略来加快骨整合的发生，实现更快、更牢固的生物学固定。在骨质疏松状态下，目前大量的研究聚焦于探索假体的材料成分、制备方式、表面结构和活性物质递送等策略来促进界面骨整合的效果，从而减少术后假体并发症。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 20,
        "chunk": "# 1.2.1 假体主体材料  \n\n假体的主体材料决定这内植物的力学性能和生物相容性，极大地影响着宿主细胞在假体界面的粘附和分化，是控制骨-假体界面骨整合的重要因素。金属材料，如钛及其合金、坦、钴铬合金等，由于其合适的生物力学特性，在骨科假体中占据主要位置。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 21,
        "chunk": "# 1.2.1.1 钛及其合金  \n\n钛及其合金由于其优异的机械性能，如高强度、耐腐蚀性、低弹性模量和自然界丰富的来源，是目前临床上用于制备内植物最常用商业材料 [88, 89]。纯钛表面形成稳定的氧化层是纯钛假体生物相容性和增强耐腐蚀能力的原因。然而，这使得钛很难蚀刻、塑性 [90]。目前，钛合金由于具有更高的孔结构和更好的塑性而被引入市场，其中 $\\mathrm{Ti_{6}A l_{4}V(6\\%}$ 铝； $4\\%$ 钒）在所有钛合金中占据最重要的位置。铝可以提高合金的强度，同时降低其密度，而钒可以防止铝腐蚀，钛合金内植物已广泛用于骨外科、牙科和血管外科的医疗领域 [91]。传统钛合金植入物采用模具铸造或减法技术制造，如机械加工、多点成形和数控加工，因此很难在真实骨组织中模拟皮质骨和松质骨的结构 [92]。随着 3D 打印技术的出现，这些问题可能会得到解决。自 2015 年以来，3D 打印医疗设备在患者直接治疗中的使用大幅增加。最常见的是外科，尤其是骨科（ $36\\%$ ）和骨科肿瘤（ $(32\\%)$ ），其次是颌面外科（ $6\\%$ ）、神经外科（ $4\\%$ ）和整形外科（ $1\\%$ ）[93, 94]。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
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        "chunk": "# 1.2.1.2 坦金属  \n\n钽金属是一种高度惰性和耐腐蚀的材料，具有极高的熔点（ $3017^{\\circ}\\mathrm{C})$ ）。与钛不同的是，钽具有很高的导热性和导电性，并且已被证明比钛更具生物相容性。钽金属表面的氧化反应有助于成骨细胞的粘附、增殖和分化，并且比常用的$\\mathrm{Ti_{6}A l_{4}V}$ 更好 [95, 96]。因此，钽金属因其快速和长期固定性而成为翻修髋关节置换术中髋臼重建的重要组成部分 [97, 98]。此外，钽也可以制成多孔植入物。由于其高体积孔隙率，钽被称为小梁金属。多孔钽的弹性模量与软骨下骨的弹性模量相似，有助于减少应力遮挡和减少骨溶解。同时，高摩擦系数使多孔坦比传统的无骨水泥假体具有更好的初始稳定性 [99, 100]。因此，坦金属制备的假体在骨质疏松状态下具有较好的骨诱导性，可获得满意的骨整合效果[101-104]。然而，多孔钽结构太薄，难以制造准确的内部形貌。此外，钽金属在自然界储存量少，提纯和制造成本高，阻碍了其广泛应用 [105]。将坦金属以粉末形式生产，并以涂层的方式在加载到其他植入物的表面，也显示出令人满意骨整合的效果 [106-108]。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 23,
        "chunk": "# 1.2.1.3 钴铬合金  \n\n钴铬（CoCr）合金因其高耐磨性和耐腐蚀性，常用于金属对金属的全髋关节置换假体。它还被发现兼具材料韧性、屈服强度、延展性和硬度方面的极好特性。钴提高了合金的强度，而铬提高耐腐蚀性。然而，添加超过 $30\\%$ 的铬会使该合金难以铸造，并导致脆性相变 [109]。因此，用于制造金对金植入物的 CoCr 合金通常含有约 $64\\%C0$ 、约 $28\\%C\\mathrm{r}$ 以及少量其他金属（如钼、铝、镍、锰、铁和镧）[110, 111]。 $\\mathbf{CoCr}$ 合金本身的特性再加上高抛光降低表面粗糙度的技术，使得假体在磨合期后的磨损率比传统假体低 40 倍，容积磨损率降低 200 倍。此外，髋臼部分直径设计较大，使得股骨头与髋臼之间的磨损程度大大减小，极大的延长了假体使用寿命，并取得良好的患者满意度 [112, 113]。然而，CoCr 合金的骨整合能力和生物相容性通常被认为低于钛合金 [114]。另一个与CoCr 合金相关的问题是，生物材料的降解将产生大量纳米颗粒，这可能导致过敏反应和细胞毒性 [115]。据报道， CoCr 合金植入物患者的血液中Co/Cr 浓度通常会升高 [116]。但降解的颗粒物与并发症之间的生物学相关性尚未得到彻底评估，也有学者认为患者血液和组织中的Co/Cr 浓度过低，不会增加系统性疾病的风险 [117]。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 24,
        "chunk": "# 1.2.2 3D 打印微孔假体  \n\n3D 打印技术是快速成型的一种，也被称为增材制造，是一种以数字模型文件为基础，使用粉末状塑料或者金属等可粘合材料作为原料，根据预设好的空间结构进行逐层打印制造物件的一种新型技术。目前，用于钛合金材料的主流 3D打印方法包括选区激光烧结（Selective laser sintering, SLS）、选区激光熔融（Selective laser melting, SLM）、电子束熔融（Electron beam melting, EBM）等 [118-120]。简要来说，3D 打印骨科假体的制备过程为首先利用软件设计或影像学 CT扫描获得预打印物体的结构外形，建立 3D 模型，然后将模型导入生成 STL 文件格式，而后将该格式文件导入 3D 打印机进行分层切片，打印出实物并对其进行后处理包括抛光和灭菌等，最后得到与预设计相符的个体化假体，并用于骨科植入（如图 1.7） [121]。  \n\n![](images/2eb9e431c5280da0cbec35b6b0428bfdb7b6bd16baa423dd1044dc5e44082e6d.jpg)  \n图1.7 3D 打印骨科假体制备过程示意图及本课题组打印获得的成品假体 [121]。  \n\n与传统假体相比，个体化设计的 3D 打印假体可以制造成微孔结构，该设计不仅具有与松质骨类似的弹性模量，可以避免应力遮挡及骨吸收，而且能够增加假体与周围骨质间的接触面积，增强界面的初始稳定性，强制性地限制界面微移动 [122, 123]。通过 3D 打印方法制备的骨科内植物具有可控的三维立体微孔结构，可维持成骨细胞形态的同时并促进其粘附、增殖及生物活性，促进成骨相关胶原（如I 型胶原和V 型胶原）的分泌，以达到诱导骨质向内生长和获得假体界面骨整合的目的 [124-126]。因此，中国食品药品监督管理局自 2015 年起，已批准具有微孔结构界面的3D 打印金属垫块、髋臼杯和椎间融合器等植入体进行临床应用。既往临床研究已证实，使用具有微孔结构修饰的 3D 打印假体在关节置换术后的可以诱导新生骨质长入假体微孔内部，有效恢复组织的结构稳定性，加强假体-骨界面良好的骨整合，显著降低术后假体翻修率 [97, 127-130]。其中，微孔结构是决定3D 打印假体骨整合效果的决定性因素，但目前对于最合适的微孔参数（包括孔径、孔隙率、微孔形状等）尚未有定论 [122]。  \n\n假体微孔尺寸影响细胞和组织在支架表面的粘附方式，及假体内部组织的物质交换。当孔径过小时（如 $<300~\\upmu\\mathrm{m}$ ）材料的表面张力较大，且桁架间距小于细胞移行跨越的距离限制，导致细胞跨越微孔沿支架表面生长，在支架表面形成薄层组织。这种新生薄层组织阻碍了新生骨组织向微孔内部的长入，将会影响骨整合的质量和强度。同时，组织薄层覆盖了支架表面微孔，阻断了支架内部新生组织的营养供应，不利于支架微孔内骨长入和新骨生成 [131]。相反，当孔径大于细胞移行跨越的距离时，细胞及组织会粘附于桁架内并向孔隙内部生长，进而实现骨长入。但孔径过大（ $(\\geq1000~\\upmu\\mathrm{m})$ ），假体与自体骨虽然能发生组织学层面的骨整合，但由于接触面积受限，导致骨整合界面总体力学结合强度不足，不能实现支架的长期稳定固定。如图 1.8 所示，近期的一项研究将 $700~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 孔径的支架孔隙率分别设计为 $40\\%$ 、 $70\\%$ 和 $90\\%$ ；而孔隙率为 $70\\%$ 的支架孔径分别为 400、700和 $900~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ，以论证孔隙大小和孔隙率协同促进体外成骨活性和体内新骨形成的最佳参数。就该研究中的孔径而言，用于提高成骨能力的最佳孔径为 $700\\upmu\\mathrm{m}(\\up p70)$ ，孔径过小或过大都可能或多或少地阻碍细胞行为和骨再生，即使孔径（300-900$\\upmu\\mathrm{m}$ ）和孔隙度（ $70\\%$ ）都在推荐值范围内；此外，在恒定孔径下（ $700\\upmu\\mathrm{m})$ ，与孔隙率为 $40\\%$ （ $\\mathtt{p40}$ ）相比，孔隙率较高的 $70\\%$ （p70）和 $90\\%$ （ $\\mathsf{p}90$ ）更有利于骨形成和骨整合[132]。  \n\n![](images/af2d836a0dff71256257c9591cf9f44d084e4b9d09049f49f549c7ade47e1f77.jpg)  \n图1.8 不同孔径、孔隙率支架的制备及其对骨形成和骨整合的影响 [132]。  \n\n除了孔径和孔隙率，在假体制备过程中通过调整走线方式，即可获得不同形态的孔隙结构。其中，三角形、正方形和正六边形是最常见的三种微孔形态。由于假体桁架间不同的排布方式，会影响细胞在假体界面上的迁移行为 [133]。研究表明桁架间夹角越小（如三角形微孔），细胞在微孔中可以有更多的粘附面积，提升细胞粘附效率，并可以接受更多的物理刺激实现成骨分化；在桁架间夹角较大（如六边形微孔）的假体中，细胞在微孔中粘附效率则相对较低 [134]。另外，有学者利用 Micro-CT 技术扫描人松质骨骨小梁结构，重建出具有天然骨小梁分布特点的3D 模型并打印出高度仿生化的微孔假体。假体中的仿生骨小梁微孔结构构建了利于BMSCs 增殖、分化的细胞微环境，并可以通过调整仿生骨小梁微孔的密度模拟自体骨骨小梁排列特征，以获得生物力学与自体骨高度相似的 3D打印钛合金微孔假体 [135]。  \n\n尽管3D 打印微孔假体的应用在一定程度上可以促进骨质疏松状态下的界面骨整合，降低假体松动和下沉的可能，但临床上使用的钛合金材料的生物惰性，以及金属微孔表面光滑等物理特征不利于 BMSCs 粘附和增殖，不利于负载可调节骨质疏松性骨微环境的活性药物，不能充分调动内源性 OP-BMSCs 的成骨作用。因此，骨质疏松状态下的假体界面周围骨质再生以及骨整合的改善仍是亟须解决的问题。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 25,
        "chunk": "# 1.2.3 假体表面涂层与改性  \n\n大量研究证明，假体表面的特性会影响周围微环境，这对骨整合来说非常重要 [27, 136, 137]。为了提高表面粗糙度、物理模拟宿主骨结构和提高植入物的生物相容性，假体表面改性技术经历了不断的发展和演变。根据表面特征，这些改性技术可分为三类：即物理改性、化学改性和生物改性（表 1.1）。这些技术可以单独使用，也可以组合使用，每种方法都有其特定的优点和局限性，必须根据植入材料、应用情况和制造程序选择合适的方法。  \n\n表1.1 改性技术分类与特定  \n\n\n<html><body><table><tr><td>种类 技术</td><td></td><td>特点</td></tr><tr><td>物理</td><td>喷砂</td><td>简单、低成本；促进骨细胞和细菌附着</td></tr><tr><td>技术</td><td>增材制造</td><td>创建复杂的3D结构；过程简单；节约材料</td></tr><tr><td></td><td>等离子喷涂</td><td>热技术；经济和安全</td></tr><tr><td></td><td>物理气相沉积</td><td>真空沉积；利用各种无机材料和一些有机材料；强</td></tr><tr><td></td><td></td><td>附着力</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>种类</td><td>技术</td><td>特点</td></tr><tr><td rowspan=\"4\">化学</td><td>机械加工</td><td>增加粗糙度的简单方法；速度慢，效率低</td></tr><tr><td>激光处理</td><td>实现复杂和精确的形貌；快速而清洁</td></tr><tr><td>阳极氧化</td><td>加速电化学过程；提高耐蚀性；创建纳米特征</td></tr><tr><td>溶胶-凝胶</td><td>低温技术；药物输送</td></tr><tr><td rowspan=\"3\"></td><td>化学气相沉积</td><td>生成精细的固体薄膜；构建均质和分层结构</td></tr><tr><td>酸蚀</td><td>制造粗糙度；取决于酸浓度、温度和时间</td></tr><tr><td>碱处理</td><td>均匀延伸；不损坏机械性能</td></tr><tr><td>生物</td><td>细胞</td><td>MSCs和胚胎干细胞等</td></tr><tr><td>技术</td><td>蛋白</td><td>直接促进成骨细胞的附着、增殖和分化</td></tr></table></body></html>  \n\n目前，钛金属是应用最广泛的骨科植入物材料，其有着生物相容性好、耐腐蚀佳、强度与天然骨接近等优势。钛合金表面会自发形成一层 $5{\\mathrm{-}}10{\\mathrm{nm}}$ 厚的 $\\mathrm{TiO}_{2}$ 氧化层 [138]。虽然有一些实验证明钛合金在体液中游离 $\\mathrm{Ti}^{4+}$ ，并吸附体液中羟基以促进 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 在植入物表面沉积，但这种氧化还原反应极其微弱，钛合金通常还是被认为是一种生物惰性材料，在植入体内后与机体间的交互反应较弱 [139, 140]。喷砂是一种典型的物理表面改性技术，它通过压缩空气的加压喷射将磨料颗粒（即砂、氧化铝、二氧化硅、羟基磷灰石、二氧化钛）压在植入物表面上 [141]。羟基磷灰石是组成人体骨骼的最主要无机成分，具有理想的骨诱导生物活性 [142]。目前，已有多种品牌型号的羟基磷灰石涂层的钛合金骨科假体上市并广泛投入临床使用 [143, 144]。针对骨质疏松状态下 ROS 堆积和 OP-BMSCs 成骨能力不足的微环境，Chen 等人通过羟基磷灰石涂层和生物分子移植在钛表面构建了一个 ROS 反应系统。将多孔羟基磷灰石和磷酸化成骨生长肽（Phosphorylated osteogenicgrowth peptide, p-OGP）引入钛表面，协同提高 OP-BMSCs 的成骨分化。ROS 在骨质疏松微环境中触发 DNA 适配体 Apt 19S 的释放，因其与 MSCs 膜上的碱性磷酸酶具有高度亲和力，可引导 OP-BMSCs 迁移至假体植入部位。一旦 OP-BMSCs 到达种植体界面，p-OGP 促进成骨相关蛋白表达，羟基磷灰石降解释放钙和磷离子，并整合到骨组织中，以促进骨基质的矿化（如图 1.9）[145]。  \n\n![](images/cc1ad4e8d4fba359f805ceb321852a1936d7139f736caff4256ec151e89a8c7f.jpg)  \n图 1.9 羟基磷灰石涂层和生物分子移植在钛表面构建了 ROS 响应的功能性钛种植体，促进骨质疏松症局部骨重建 [145]。  \n\n另外，植入物的表面的微观形态对骨整合效果也具有明显的影响。关节假体柄根据其表面形态可以分为光滑面、粗糙面、珊瑚面、微丝面、微孔面等类型 [146,147]。经长期临床观察验证，光滑面的植入物不易与自体骨间形成高强度骨整合，从而易导致假体下沉、松动等植入术后并发症的发生。经表面处理后的植入物，其表面粗糙度增加，提高了亲水性和表面积，可以促进细胞在植入物表面的粘附效率，为骨整合中新骨生长提供了更多的结合面积，利于形成高强度的骨-植入物连接界面 [148, 149]。此外，钽、镁、锶等金属已被证实具有较好的骨诱导功能，也可作为钛合金假体的表面涂层而促进骨整合 [150]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 26,
        "chunk": "# 1.2.4 局部递送活性物质  \n\n除了针对假体的材料、制备方式和表面改性这些策略来增加假体界面的活性，局部递送活性物质调节骨质疏松微环境是另一个重要的手段来加强假体界面骨整合。与间接成骨刺激方法（物理和化学表面改性）相反，包括细胞封装和生物活性因子或药物负载在内的局部活性物质递送技术，可直接促进成骨相关细胞的附着、增殖和分化。各种细胞和活性因子被负载到多孔植入物表面或内部：如MSCs、胚胎干细胞、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）、骨 形 态 发 生 蛋 白 -2 （ Bone morphogenetic protein-2, BMP-2 ） 和 骨 保 护 素（Osteoprotegerin, OPG）等，并在骨质疏松状态下获得满意的假体界面骨整合效果 [151-157]。为了抑制骨质疏松症局部过度的骨吸收并促进假体界面骨整合，我们先前的研究构建了一种 3D 打印多孔钛合金/泊洛沙姆407 水凝胶系统，以装载经典的抗骨质疏松药物——唑来膦酸。这种复合假体具有良好的生物相容性，随着水凝胶的降解，能够持续释放低浓度的唑来膦酸，抑制破骨细胞的分化的同时促进OP-BMSCs 增殖和成骨分化，从而促进骨质疏松状态下的假体界面骨整合（图1.10）[154]。  \n\n![](images/66060e454b761ed7cf75f0e677cbe8c13618fcd839ff182d7a7e29235e4f127c.jpg)  \n图1.10（A）负载唑来膦酸的 3D 打印多孔钛合金/泊洛沙姆407 水凝胶系统以促进骨质疏松假体界面骨整合示意图；（B）3D 打印多孔钛合金及其负载水凝胶后的外观及微观图像；（C）Micro-CT 三维重建观察假体界面骨长入与骨整合 [154]。  \n\n近年来，除了使用骨吸收抑制剂外，合成代谢药物在抗骨质疏松方面的开发也引起了研究者们更多的关注。特立帕肽，也称为 1-34 人甲状旁腺激素（1-34human parathyroid hormone, PTH），是目前美国食品和药物管理局（FDA）批准用于治疗骨质疏松症的唯一合成代谢药物 [158]。通过将特立帕肽封装在泊洛沙姆407 水凝胶中，构建可注射局部药物缓释系统可上调 Runx-2、Col-1、骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）的表达，有利于 BMSCs 的增殖、迁移和成骨分化，促进骨质疏松性骨缺损的愈合 [159]。然而，这种局部活性物质递送的策略对假体界面骨整合的效果因种子细胞的种类、密度、分化潜能以及活性物质和药物的选择及其释放策略而异。之前的一项研究显示，PTH 具有同时激活成骨细胞和破骨细胞的独特能力，并且局部持续释放 PTH 显示对破骨细胞比成骨细胞的激活程度更高，从而导致净骨吸收 [160]。随着对特立帕肽不同释放节律的更详细研究，有报导表明，负载还原氧化石墨烯壳聚糖水凝胶通过光热触发的特立帕肽仿生脉冲释放比持续药物递送对骨质疏松性骨再生的效果更为满意 [161]。值得探索的是，有人提出脉冲式释放的 PTH 在促进骨再生方面也存在一些缺陷，例如小鼠颅骨骨缺损修复的结果表明，PTH 脉冲组仍有许多材料残留 [162]。其原因可能是虽然脉冲释放大大增强了成骨细胞的活性，但对破骨细胞的激活作用太弱，因此植入缺损处的材料降解速度与骨形成速度不匹配，从而导致缺损处的骨修复不够彻底 [163]。因此，Kuang 等人提出了一种刺激响应的双模式系统（连续 $+$ 脉冲模式）来精确控制局部PTH 释放。具体而言，通过聚合物聚 N-丙烯酰甘氨酸-丙烯酰胺共聚物（PNAm）和吲哚青绿（ICG）的自组装，合成了近红外光调制的热敏聚合物微球。微球与 PTH 络合后，再与水凝胶混合，注入骨缺损部位。在双模式释放系统下 PTH 以低浓度持续释放，在近红外光照射下脉冲释放 PTH。结果表明，这种 PTH 的双模式释放平台可以同时协同增强成骨细胞和破骨细胞的活性，并在骨质疏松性骨缺损中获得比连续给药和单独脉冲释放更好的修复结果（图 1.11）。此外，生物活性物质如何递送到靶部位并维持活性发挥高效作用，也是获得良好骨整合效果至关重要的因素[164]。  \n\n![](images/f0196c301acadca86d790288b16d0b2945f6b593c308e1493abb2d6bb37e8f3c.jpg)  \n图 1.11（A）近红外光响应负载 PTH 的 PNAm/ICG 微球的制备示意图；（B）可注射的PTH 双模式释放策略修复骨质疏松大鼠骨缺损；（C）通过Micro-CT 对缺损部位进行三维重建，以评估 12 周骨质疏松大鼠的骨再生；（D）不同药物释放模式下成骨细胞和破骨细胞的活性调节示意图 [164]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 27,
        "chunk": "# 1.3 局部活性物质递送策略  \n\n局部活性物质递送体系能实现对治疗剂的负载和可控释放，提高病灶部位药物的富集量和利用率，降低全身用药的剂量及毒副作用，是近年来生物组织工程领域的研究热点。根据局部活性物质递送策略的不同，可分为植入式的体内递送系统和经皮式的体外递送系统。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 28,
        "chunk": "# 1.3.1 体内局部递送系统  \n\n局部递送系统通常包括网络结构和颗粒结构，其中，网络结构系统包括支架、水凝胶和纳米纤维，而常见的颗粒结构系统包括纳米乳液 、胶束、固体脂质纳米粒（SLN）、纳米结构脂质载体（NLC）、脂质体和聚合物纳米胶囊等（图 1.12）[165]。其中，水凝胶由于具有三维多孔网络结构和良好的生物相容性，已被广泛开发为外泌体、生长因子、药物等的持续局部递送载体，成为骨组织工程支架的极佳候选者，为探索和理解细胞生态微环境提供了一个良好的体内外活性因子的负载模型。水凝胶特有的多孔网络结构为负载药物提供足够的空间，同时可通过降解控制释放药物，其可控的药物释放动力学潜在地解决传统药物治疗中的弥散性和突释问题。而面对众多的生物材料，了解不同活性物质（药物、生长因子、外泌体）负载与控释的通用策略，更有目的性地去选择合适的凝胶基材，对于获得满意的骨再生和骨整合效果具有重要的意义。  \n\n![](images/3ddb466b1efaf484a50c2dd145a3356a1540d92c6ead5564f008a74ab12ae1da.jpg)  \n图1.12 常见局部体内药物递送系统 [165]。  \n\n水凝胶作为药物递送体系的性能取决于凝胶的物理和化学性质以及治疗剂的装载机制。如图 1.13 所示，水凝胶负载活性物质的方式包含三种主要方法：物理包埋/混合、静电吸附、共价锚定，每种方法都有其特定的优缺点，应在考虑所用水凝胶网络以及药物性质后进行选择 [166]。水凝胶负载活性物质后，可在生理条件下实现缓释药物的效果，其控释方式包含被动扩散（一般借助水凝胶内外的渗透压差）、主动释放（如凝胶网络的瓦解等）[167]。此外，相关负载与控释领域的水凝胶设计常涉及不同类型的外界刺激（如 pH、温度、活性酶和炎症介质浓度等），以凸显药物递送型水凝胶构建的创新性，即在外界刺激下，实现原位药物可控的智能化递送。在相关研究中，水凝胶扮演骨架的角色，并在此骨架中引入刺激响应性的链段设计，或引入偶联药物/活性因子的中间桥梁，进而锚定药物。其本质是利用凝胶骨架上可共价反应的活性官能团（如- $\\scriptstyle\\cdot C=C-$ 、-COOH、-NH2等）或通过静电作用、疏水缔合非共价键作用等，来实现药物的有效负载。比如，丙烯酰化-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯（AC-PEG-NHS）是一种双功能 PEG 交联剂，属于异官能团双取代聚乙二醇衍生物，其一端修饰有丙烯酸酯基团，另一端修饰有NHS 基团。其中，丙烯酸酯可参与双键修饰类聚合物光固化凝胶体系的构成，而 NHS 可与蛋白或药物分子上的氨基（ $\\left.-\\mathrm{NH}_{2}\\right.$ ）反应形成稳定酰胺键，因此可实现目标蛋白或药物与双键修饰高分子的桥联作用，延缓缓释周期，避免药物的突释。基于该原理的材料体系已被广泛应用于药物负载、蛋白锚定等生物医学领域。  \n\n![](images/980ab05242919b92af6ff5a827442d3432b5a86ef76d2babcb6f910b8a1fb099.jpg)  \n图1.13 水凝胶负载药物的不同策略及其特点 [166]。  \n\n此外，生长因子一般是指对机体生长、发育具有广泛而特定的调节作用一些活性蛋白类或者多肽类物质。若涉及单一生长因子的控释或生长因子协同治疗对组织的修复等方向，药物负载与控释的方式同样适用于生长因子，即通过物理共混、化学键合、静电作用（可根据蛋白的等电点来设计，利用静电作用）等方式负载于光固化凝胶载体中。而对于细胞和外泌体的负载与控释，一般选择简单的物理共混，以最大程度减少细胞和外泌体的功能活性损失。我们先前的研究使用通过原位交联 N-羧乙基壳聚糖、己二酸二酰肼与透明质酸醛，制备了可注射和自愈合的超分子多糖水凝胶，用于递送 BMP-2 和BMSCs 并与3D 打印微孔钛合金支架复合构建生物活性假体。如图1.14 所示，这种 3D 打印生物活性假体界面能够极大的促进骨质疏松状态下的内植物骨整合 [154]。  \n\n![](images/3b168705dbdad73c444b06f156f7589e8d83dfabe31949c0d5d66225df5bb911.jpg)  \n图1.14 （A）负载 BMP-2 和BMSCs 的超分子水凝胶与 3D 打印微孔钛合金支架复合构建生物活性假体。（B）3D 打印生物活性界面促进骨质疏松状态下假体界面骨整合 [154]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 29,
        "chunk": "# 1.3.2 体外经皮递送系统  \n\n除了体内植入式的局部递送系统，体外经皮药物递送包括化学增强剂、离子导入/电穿孔、超声、喷射注射和微针系统等，已被广泛研究并逐渐应用于临床（图 1.15）[168]。其中，经皮超声介导的局部药物递送因其精准可控、安全无创的特性而备受关注。早在 1950 年，Fellinger 和 Schmidt 首次报道用氢化可的松软膏结合超声导入成功治疗手部指关节多关节炎，随后研究者发现超声波可以辅助增强药物、蛋白质、DNA/RNA 和其他一些化合物在细胞和组织的吸收，在此研究基础上，创建了无创的超声介导的药物递送理论 [169]。经皮超声导药仪器的原理主要是通过可控的电信号经过放大作用后到达压电晶体，在换能器的尖端转换为经皮药物递送所需要的超声波。高能量的超声波集中在皮肤上时，通过热效应、空泡化效应和声流效应三种主要机制对组织和细胞产生影响 [170]。通过这些作用可使皮肤、组织膜形成或\\和扩大已形成孔道，使其通透性增加，增强药物的渗透作用。此外，这些效应还可使药物粒子获得向特定方向运动的动能，即沿着声波传播的方向做定向运动，从而实现药物靶向运输，并使局部组织和细胞内药物浓度达到预定的浓度。超声透皮给药法是一种安全有效的给药策略，可部分替代传统的注射给药，特别是对生物大分子药物，可以实现给药的最优化 [171, 172]。  \n\n![](images/94fcd9cfb7c2fd00d5562bf464e4e807201327431a0ecc25cb2f2e81d41517e5.jpg)  \n图1.15 常见不同机制经皮给药的代表性策略，包括化学促进剂促进、电动促进、机械力触发和微针辅助给药系统 [168]。  \n\n超声波作用频率、强度和时间是决定上述几个效应、及其对皮肤损伤的关键参数。组织的声波吸收系数随着超声频率的增加而增加；此外，空泡化效应也由超声波频率决定，空泡直径与超声波频率呈反比，且空泡尺寸越大，其稳定性越差 [170]。在固定频率超声下，组织温度升高幅度与超声强度和作用时间直接相关[173]。在应用过程中，超声波强度也应受到限制，以避免潜在的皮肤损伤。总的来说，经皮超声介导药物递送中使用的超声条件主要集中在频率为 $0.02\\mathrm{-}16\\mathrm{MHz}$ ，强度为 $0.008{-}50\\mathrm{W/cm}^{2}$ 之间变化 [174]。与被动给药相比，超声介导的递送特征性药物转运增强约可提高 10 倍 [175]。低频超声（ ${<}100\\mathrm{kHz}$ ）对药物经皮递送的效率明显大于高频超声（ ${>}700\\mathrm{kHz}$ ）[170]。例如，低频超声波对于皮肤通透性的改善作用明显强于高频超声波，如 $20~\\mathrm{kHz}$ 的低频超声介导的经皮给药效果大约为1 MHz 高频超声波作用的 3 倍 [176]。Merino 等人报道的另一个例子表明，与低频超声（ $20~\\mathrm{kHz}$ ）相比，使用高频超声（ $10~\\mathrm{MHz}$ ）没有引起药物递送效率增强[177]。近些年，随着科技的不断进步，低频超声波经皮给药的研究得到了广泛的开展 [178, 179]。相较于临床常用的静脉穿刺给药方式，低频超声介导的药物输送具有无痛、无创、感染风险低、病人满意度高、对血管刺激小的优点。目前随着低频超声给药技术的不断成熟，在临床上，已经开发出了相关的操作仪器，且在众  \n\n多的临床科室投入使用。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 30,
        "chunk": "# 1.4 选题目的与主要研究内容  \n\n目前，临床上接受关节置换手术的患者多数为老年患者，常伴有骨质疏松，在假体植入后由于局部骨质不良、骨再生能力不佳，造成骨整合效果不理想，从而导致术后假体松动、移位和假体周围骨折等并发症高发。骨整合的发生很大程度依赖骨-假体界面的生物活性和附近参与骨再生细胞的功能。经上综述可知，骨质疏松状态下的骨再生和骨整合能力受限，可能是部分由于 OP-BMSCs 低下的自噬能力导致细胞活性和增殖能力低下，成骨分化不足，趋向于成脂分化而造成。因而，在利于骨长入的 3D 打印微孔假体界面负载可激活 OP-BMSCs 自噬活性的药物，是恢复 OP-BMSCs 细胞活性和功能，促进假体界面骨整合的潜在策略。经皮超声介导的药物递送具有精准可控、安全无创的特点，且可根据实际情况方便地进行药物种类或者剂量的调整，是一个局部给药的优选策略。考虑到通过特制的超声电导仪频繁的经皮给药，可能导致患者依从性差，且增加了经济和时间负担，所以本研究还构建了一种“3D 打印金属微孔/水凝胶的生物活性界面”作为一站式植入物，在体内进行长期、稳定的雷帕霉素缓释，是另一种可供选择的策略。因此，本研究拟通过构建经皮超声介导雷帕霉素递送和功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送两种策略，上调 OP-BMSCs 的自噬水平，以恢复下降的细胞活性（包括细胞活力、增殖、迁移和成骨）和抑制成脂分化，从而促进 3D打印微孔假体界面在骨质疏松状态下的骨整合。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 31,
        "chunk": "# 第 2 章  经皮超声介导雷帕霉素递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合  \n\n骨质疏松症患者骨髓中的 OP-BMSCs 具有受损的细胞功能和低下的成骨活性，导致假体植入后骨整合不足，增加了关节置换术后灾难性并发症的发生的风险。OP-BMSCs 低下的自噬活性是导致细胞功能低下和骨整合不良的重要因素，而低下的细胞自噬活性可以通过经典的自噬激活剂——雷帕霉素激活。因此，在骨质疏松环境下，通过局部递送雷帕霉素激活 OP-BMSCs 自噬以促进 3D 打印假体界面的骨整合具有重要意义。经皮超声介导药物递送作为一种无创的药物递送方式而备受关注。在本研究体系中，我们将雷帕霉素作为模型药物，通过经皮超声介导递送来上调 OP-BMSCs 的自噬水平，以恢复下降的细胞活性（包括细胞活力、增殖、迁移和成骨）和抑制成脂分化，从而改善假体界面骨整合（如图 2.1）。  \n\n![](images/058ecb3be349ddb43be485bf4fdc1a6473b3b99aa053f2989740aa205d3d6138.jpg)  \n图 2.1 经皮超声介导雷帕霉素递送激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下微孔界面骨整合。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 32,
        "chunk": "# 2.1 3D 打印微孔假体界面的制备与表征",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 33,
        "chunk": "# 2.1.1 实验仪器与材料  \n\n2.1.1.1 实验仪器   \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器</td><td>品牌</td></tr><tr><td>EBM机</td><td>瑞典 Arcam 公司</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>上海比朗仪器制造有限公司</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>德国Bruker 公司</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>日本JEOL公司</td></tr><tr><td>高压灭菌锅</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr><tr><td>干燥箱</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr><tr><td>万能力学测试机</td><td>上海长肯试验设备有限公司</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海花潮电器有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n2.1.1.2 主要试剂  \n\n\n<html><body><table><tr><td>试剂</td><td>品牌</td></tr><tr><td>Ti6Al4V粉末</td><td>北京爱康医疗</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>山东利尔康医疗科技有限公司</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 34,
        "chunk": "# 2.1.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 35,
        "chunk": "# 2.1.2.1 3D 打印钛合金微孔支架的制备  \n\n以 $\\mathrm{Ti}_{6}\\mathrm{Al}_{4}\\mathrm{V}$ 粉末为原料，通过 EBM 技术打印仿生钛合金微孔假体：直径为 10$\\mathrm{mm}$ ，高度 $3.5~\\mathrm{mm}$ 的平板状支架用于细胞实验和理化性能测试；直径为 $6~\\mathrm{mm}$ ，高度 $10\\mathrm{mm}$ 的柱状支架用于动物实验。具体步骤如下：  \n\n1) 使用 CAD 软件准备微孔支架的 STL 文件模型。支架形状设计为上述的平板状和圆柱状，孔径为 $800~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ，孔隙率为 $70\\%$ ；  \n\n2) 使用 Cura 软件对将 STL 文件模型进行切片处理，设置层间叠加角度为$90^{\\circ}$ ，并输出为G-code 文件；  \n\n3) 将 G-code 文件导入 EBM 系统，成型仓中填充 $\\mathrm{Ti}_{6}\\mathrm{Al}_{4}\\mathrm{V}$ 粉末，粒径为 10-$50~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ，在真空、 $700\\mathrm{~\\textdegree~}$ 条件下，投射直径为 $100~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 电子束流，以 $10000\\ \\mathrm{mm/s}$ 速度进行逐层熔融成型；4) 不同形状的微孔支架打印完成后，在无水乙醇和去离子水中清洗，超声震荡，每次处理 $15\\mathrm{min}$ ，以去除支架孔隙内残余 $\\mathrm{Ti}_{6}\\mathrm{Al}_{4}\\mathrm{V}$ 粉末；5) 对获得的支架进行高压蒸汽灭菌消毒（ $\\langle121^{\\circ}\\mathrm{C},30\\mathrm{min}\\rangle$ ，无菌条件保存供后续实验使用。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 36,
        "chunk": "# 2.1.2.2 3D 打印钛合金微孔支架的表征  \n\n1) 使用 Micro-CT 扫描（电压： $102\\mathrm{kV}$ ，电流： $100\\mathrm{mA}$ ）对3D 打印微孔支架的结构进行观察，并分析孔隙率。  \n2) 对微孔支架进行喷金处理后，使用扫描电子显微镜，在 $3\\mathrm{kV}$ 的加速电压下，对3D 打印微孔支架表面形态进行观察，并分析孔径大小。  \n3) 使用万能力学测试机对支架的力学性能进行表征。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 37,
        "chunk": "# 2.1.2.3 数据统计分析  \n\n每组实验均重复 3 次或 3 次以上，计数结果以均数 $\\cdot\\pm$ 标准差的形式表现，两组数据间的比较用独立 t 检验，两组以上数据用 one way ANOVA 伴随 Student-Newman-Keuls post-hoc 检验校正，当 $p{<}0.05$ 表示组间差异有统计学意义。统计学分析使用SPSS 软件。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 38,
        "chunk": "# 2.1.3 实验结果  \n\n如图 2.2A 所示，通过 3D 打印技术，我们成功制备了平板状和圆柱状的两种形状的钛合金微孔支架。平板状支架，直径为 $10~\\mathrm{mm}$ ，高为 $3.5~\\mathrm{mm}$ ，横向桁架数为12，纵向桁架数为 4；圆柱状支架直径为 $6\\mathrm{mm}$ ，高为 $10\\mathrm{mm}$ ，横向桁架数为 7，纵向桁架数为 12。两种形状支架的层间桁架均是以 $90^{\\circ}$ 直角交角连接，支架微孔的形状为正方形，表面微孔分布均匀，可见孔间良好的互通结构。  \n\n通过对支架进行 Micro-CT 扫描并定量分析可知微孔支架的孔隙率为$69.2{\\pm}0.9\\%$ 。使用扫描电子显微镜对微孔支架的表面形貌行观察，如图2.2B 所示，微孔的平均直径为 $796.0{\\pm}1.9\\upmu\\mathrm{m}$ ，微孔形态及分布较为均匀，桁架排列规则，桁架之间交角为 $90^{\\circ}$ ，微孔连续性良好。在高倍视野下，可见支架的桁架上分布着较多直径为 $10{-}50~\\upmu\\mathrm{m}$ 的未熔解的 $\\mathrm{Ti_{6}A l_{4}V}$ 粉末。随后，使用万能力学测试机对微孔支架的力学性能进行检测，抗压强度测量期间的荷载-位移曲线转换为应力-应变曲线，并根据曲线计算显示抗压强度为 $48.0{\\pm}2.1\\mathrm{MPa}$ ，而微孔支架的弹性模量为 $1.63{\\pm}0.2\\mathrm{GPa}.$ 。  \n\n![](images/3a4f0a94e8f097d8dfd753a797a83ebb42e7c951638f01df97740ec0b7368e06.jpg)  \n图2.2（A）平板状和圆柱状 3D 打印钛合金微孔支架外观；（B）扫描电镜观察支 架微观结构的图像。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 39,
        "chunk": "# 2.1.4 讨论  \n\n假体的骨整合能力通常取决于其组成材料的骨传导性，这进一步与假体的孔隙率、孔径分布程度有关。数十年来，骨科医生及生物材料研究者试图寻找出最利于骨长入与整合的假体表面微孔的孔径尺寸。Polo-Corrales 等人研究发现，100$\\upmu\\mathrm{m}$ 的孔径是实现骨-假体界面整合的最低孔隙尺寸指标，低于这一孔径可能会对孔隙中的血管长入及骨形成存在阻碍作用 [131]。 $100{-}500~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 的孔径可能有利于成骨细胞的粘附、增殖和分化 [121, 180]。本课题组前期对已发表的骨科微孔植入物的孔径尺寸进行了综述总结，并论证得出假体表面微孔尺寸在 ${500-800\\upmu\\mathrm{m}}$ 时，植入物界面具有最佳的诱导骨长入和骨整合效果 [122]。对于骨组织工程微孔支架，孔隙率也是影响微孔结构植入物生物学功能的关键指标。人体松质骨的孔隙率通常为 $75\\mathrm{-}90\\%$ 。微孔支架的孔隙率在 $50\\%$ 以上，尤其是在 $60\\text{\\textperthousand}$ 的范围内，在结构和机械性能上与人体小梁骨相似 [181]。  \n\n随着 3D 打印技术的兴起及优化，使得个体化、精准制造的微孔假体更易实现。与传统的减材制造方法相比，通过 3D 打印增材制造技术生产的微孔支架的孔径尺寸、形态和孔隙率等参数更易控制，且微孔间互通性良好 [182, 183]。因此，我们通过3D 打印技术制备获得了本研究使用的微孔钛合金支架。就力学性能而言，皮质骨的抗压强度和弹性模量分别为 100−250MPa 和7−20GPa，松质骨的相应值分别为 $11{-}24~\\mathrm{MPa}$ 和 $1.5{-}11.2\\ \\mathrm{GPa}\\ ^{[184]}$ 。本研究中使用的3D 打印微孔假体抗压强度为 $48.0{\\pm}2.1\\ \\mathrm{MPa}$ ，弹性模量为 $1.63{\\pm}0.2\\ \\mathrm{GPa}$ ， 具有较好的力学仿生性能，可以作为负重区域的植入材料，起到支撑作用。同时，与钛及其合金相比，3D 打印微孔钛合金假体的抗压强度和弹性模量明显降低，这可以在一定程度上避免假体植入后的应力屏蔽和骨溶解 [185]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 40,
        "chunk": "# 2.1.5 小结  \n\n我们通过 3D 打印技术获得的微孔钛合金支架，孔隙率和孔径分别约为$69.2{\\pm}0.9\\%$ 和 $796.0{\\pm}1.9~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ，与预设的参数相符。这种具有高孔隙率和仿生力学性能的微孔支架预期可以扩大的界面表面积、增加表面粗糙度、改善植入物的初始稳定性、诱导骨向内生长，从而减少假体植入后的微动并促进界面骨整合。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 41,
        "chunk": "# 2.2 骨质疏松家兔模型建立及 BMSCs 提取、培养和鉴定",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 42,
        "chunk": "# 2.2.1 实验仪器与材料  \n\n2.2.1.1 实验仪器   \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>超净操作台</td><td>美国Airtech公司</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>恒温水浴锅</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr><tr><td>台式低速离心机</td><td>上海秋佐科学仪器有限公司</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>日本 Olympus 公司</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr><tr><td>冰箱</td><td>青岛海尔生物医疗股份有限公司</td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>青岛海尔生物医疗股份有限公司</td></tr><tr><td>高压灭菌锅</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr><tr><td>干燥箱</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>外科手术器械</td><td>杭州青牛医疗器械有限公司</td></tr><tr><td>移液器</td><td>德国Eppendorf 公司</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>上海求精生化试剂仪器有限公司</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>美国Corning公司</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>上海比朗仪器制造有限公司</td></tr><tr><td>离心管</td><td>美国Corning公司</td></tr><tr><td>液氮容器</td><td>成都金凤液氮容器有限公司</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海花潮电器有限公司</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>德国Bruker 公司</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>美国Thermo 公司</td></tr></table></body></html>  \n\n2.2.1.2 主要试剂  \n\n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>L-DMEM培养基</td><td>美国Gibco公司</td></tr><tr><td>青链霉素</td><td>美国Gibco 公司</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>美国Gibco公司</td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶</td><td>美国Gibco公司</td></tr><tr><td>BMSCs成骨诱导培养基</td><td>美国Hyclone 公司</td></tr><tr><td>BMSCs成软骨诱导培养基</td><td>美国Hyclone 公司</td></tr><tr><td>BMSCs成脂诱导培养基</td><td>美国Hyclone公司</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>上海Aladdin 生化科技有限公司</td></tr><tr><td>PBS缓冲液</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>鼠抗兔CD90抗体</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>鼠抗兔CD105抗体</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>鼠抗兔CD45抗体</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>羊抗鼠二抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>山东利尔康医疗科技有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>75%医用酒精</td><td>山东利尔康医疗科技有限公司</td></tr><tr><td>碘伏毒液</td><td>山东利尔康医疗科技有限公司</td></tr><tr><td>兽用青霉素</td><td>华北制药集团有限责任公司</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>兔雌激素ELISA试剂盒</td><td>上海恒远生物科技有限公司</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶试剂盒</td><td>上海碧云天生物科技有限公司</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝染色液</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>油红O染色液</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 43,
        "chunk": "# 2.2.1.3 实验动物  \n\n新西兰大耳白兔：由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 44,
        "chunk": "# 2.2.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 45,
        "chunk": "# 2.2.2.1 骨质疏松动物模型制备  \n\n1）雌性5 月龄新西兰大耳白兔，体重约 $2.5\\mathrm{kg}$ ，共106 只，适应性饲养 1 周后通过双侧卵巢切除术（Ovariectomy, OVX）制备骨质疏松模型。具体来说，术前12 小时禁食水，通过耳缘静脉注射 $3\\%$ 戊巴比妥钠（ $(50\\mathrm{mg/kg})$ ）进行全身麻醉，充分麻醉后腹部术区常规备皮，仰卧位固定于手术台，消毒、铺单。取下腹部正中切口，约 $2{-}3~\\mathrm{cm}$ 长，子宫位于膀胱的背侧，呈明显的粉红色。如果一开始未找到子宫，可轻轻牵拉将盲肠或膀胱拨至一旁以暴露子宫。辨认出子宫后，用手指或镊子轻轻抓住子宫并将其提拉出腹腔，沿子宫角追踪输卵管，卵巢位于输卵管头侧。轻轻提拉卵巢蒂以获得较好的视野观察组织，用小的蚊式止血钳穿过卵巢蒂进行钳夹。然后用 4-0 可吸收线在卵巢下方结扎。结扎后完整切除卵巢，并检查确认血管无出血后将组织放回腹腔。同理，结扎并切除另一侧卵巢。观察无明显出血后关闭腹腔。假手术组（Sham）为寻找到卵巢后不做结扎和切除处理即放回腹腔，缝合腹部切口。术后动物在笼内自由活动，术后连续 3 天肌肉注射青霉素（ $1.5\\mathrm{mg/kg})$ ），切口碘伏消毒以防止感染。其中 OVX 组数量为 89 只，Sham数量为 17 只。术后 10 个月，OVX 组与 Sham 组各取 5 只，收集血液和骨组织样本验证骨质疏松疏松模型建立。  \n\n2）术后 10 个月，收集全血样本 $5\\mathrm{ml}$ ，室温放置 2 小时后于 $1000\\ \\mathrm{g}$ 离心 20min，取上清，按照酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒说明书进行检测，加入终止液后，于 $15\\mathrm{min}$ 内使用酶标仪在 $450\\mathrm{nm}$ 波长处测定各孔的OD 值，并绘制标准曲线计算个样本雌激素浓度。  \n\n3）术后 10 个月，使用过量麻醉法处死实验动物，收集股骨样本。采用 Micro-CT 对股骨远端进行扫描，并通过骨形态计量学分析骨密度（Bone mineral density,BMD）和骨体积分数（BV/TV）确认骨质疏松状态。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 46,
        "chunk": "# 2.2.2.2 BMSCs 分离和培养  \n\n将兔子安乐处死后，在严格无菌操作下分离四肢长骨，无菌提取新鲜骨髓血，采用梯度离心法，即在 $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 下 $1200\\mathrm{rmp}$ 离心 $10\\mathrm{min}$ ，获取 BMSCs。含 $20\\%$ 胎牛血清、 $1\\%$ 青-链霉素的低糖 DMEM 作为完全细胞培养基。将获得的细胞置于培养皿中，并加入 $10\\mathrm{ml}$ 完全培养基，在 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 、 $5\\%C O_{2}$ 环境的培养箱中进行细胞培养。24 小时后进行半换液，之后每三天进行细胞换液，待细胞融合度超过 $80\\%$ 后，进行消化传代。其中，骨质疏松来源的 BMSCs 标记为OP-BMSCs，健康来源的 BMSCs 标记为 H-BMSCs。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 47,
        "chunk": "# 2.2.2.3 BMSCs 细胞表面抗原鉴定  \n\n$0.25\\%$ 胰蛋白酶 $2~\\mathrm{ml}$ 加入培养皿中对 BMSCs 进行消化， $2~\\mathrm{min}$ 后加入等量低糖DMEM 培养基，离心（ $1000\\mathrm{rmp}$ ，5 min）后弃上清并用PBS 重悬细胞，调整细胞浓度为 $1{\\times}10^{6}/\\mathrm{ml}$ 。吸取细胞悬液 $1~\\mathrm{ml}$ 于离心管中， $50\\%$ 乙醇透化处理 30min，离心（ $1500\\mathrm{rmp}$ ， $10\\mathrm{min}\\dot{.}$ ）后制备单细胞悬液 $100\\upmu\\mathrm{l}$ ，加入一抗抗体（CD45、CD90、CD105），常温孵育 $30~\\mathrm{min}$ ，离心去上清液，加入 FITC 标记的二抗避光孵育 $30\\mathrm{min}$ ， $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，PBS 洗涤离心去上清液，加入 PBS 重悬细胞，将流式管中的样品上机进行测试。其中设置两个对照组：包括空白对照组为不加一抗、不加二抗；阴性对照组不加一抗、只加二抗。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 48,
        "chunk": "# 2.2.2.4 BMSCs 成骨诱导及鉴定  \n\n1）将 BMSCs 以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度接种至 24 孔板中，待细胞贴壁后换液，使用成骨诱导培养基进行随后的诱导培养，每 3 天进行换液，成骨诱导培养 14 天；  \n\n2）BCIP/NBT 染色液工作液配制：ALP 显色缓冲液 $3\\mathrm{ml+BCIP}$ 液 $10\\upmu\\mathrm{l}{+}\\mathrm{NBT}$ 液 $20\\upmu\\mathrm{l}$ ；  \n\n3） $10\\%$ 多聚甲醛固定细胞 $10~\\mathrm{min}$ ，弃去固定液，PBS 洗涤，每孔中加入配置好的染色液工作液 $300\\upmu\\mathrm{l}$ ，室温避光孵育 $30\\mathrm{min}$ 后去离子水洗涤终止染色，镜下观察拍照。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 49,
        "chunk": "# 2.2.2.5 BMSCs 成软骨诱导及鉴定  \n\n1）将 BMSCs 以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度接种至 24 孔板中，待细胞贴壁后更换软骨诱导培养基进行培养，每 3 天进行换液，成软骨诱导培养 14 天；  \n\n2）用 $10\\%$ 多聚甲醛固定细胞 1h，弃去固定液，自来水冲 $15\\mathrm{min}$ ，蒸馏水洗1 次，每孔中加入甲苯胺蓝染色液 $400\\upmu\\mathrm{l}$ ，室温下浸染 $15\\mathrm{min}$ ， $95\\%$ 酒精洗去多余染液 ，滤纸吸干，光镜下观察。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 50,
        "chunk": "# 2.2.2.6 BMSCs 成脂诱导及鉴定  \n\n1）将 BMSCs 以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度接种至 24 孔板中，待细胞贴壁后换液，使用成脂诱导培养基A 液进行培养，3 天后换用成脂诱导培养基B 液进行培养 $24\\mathrm{h}$ 。  \n\nA、B 培养基交替使用培养至第 21 天；  \n\n2） $10\\%$ 多聚甲醛固定细胞 $10\\mathrm{min}$ ，弃去固定液，PBS 洗涤，加入油红 O 染色液 $400~\\upmu\\mathrm{l}$ 孵育 $30~\\mathrm{min}$ ，移除油红 O 染液，并用 PBS 洗涤 2 次，光镜下观察。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 51,
        "chunk": "# 2.2.2.7 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 52,
        "chunk": "# 2.2.3 实验结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 53,
        "chunk": "# 2.2.3.1 骨质疏松动物模型制备  \n\n如图 2.3A 所示，雌性新西兰大耳白兔在双侧卵巢切除 10 个月后，血清雌激素水平为 $11.8{\\pm}3.2\\mathrm{pg/ml}$ ，相较于假手术组（ $(42.3{\\pm}6.2\\mathrm{pg/ml})$ ）明显降低。Micro-CT扫描后对股骨远端骨质进行三维重建，如图 2.3B，OVX 组可见骨量减少、骨组织的微观结构退化，具体表现为骨皮质变薄，骨小梁数量减少。进一步骨形态计量学分析显示相较于假手术组，OVX 模型组的骨体积分数（如图 2.3C）和骨密度（如图2.3D）显著降低。综上，可确认在双侧卵巢切除术后 10 个月，骨质疏松动物模型成功建立。  \n\n![](images/b4b642d986ecb066c0f4809eb379beea3b8e0f44e5c342cda1925efa1c5ffe4c.jpg)  \n图2.3（A）血清雌激素水平；（B）Micro-CT 三维重建图；（C）骨体积分数定量分析；（D）骨密度定量分析（ $\\because p<0.01$ ; ${***p}<0.001\\rangle$ ）。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 54,
        "chunk": "# 2.2.3.2 BMSCs 生长和形态学特点  \n\n分离获得的 BMSCs 起初呈现为透明球形，24 小时后可见细胞贴壁呈短梭形，48 小时后可见明显条索状排列的梭形细胞。如图 2.4 所示，培养 5 天后 H-BMSCs 融合度达到 $80\\%$ 以上，细胞排列较为致密、规则，而 OP-BMSCs 融合度稍低于 H-BMSCs。  \n\n![](images/44d5109889b3d7f6e9bce896c7a46a9815804947eb6aa5f6cfe99186a56c3a5f.jpg)  \n图2.4 骨质疏松来源的 BMSCs 与健康来源的 BMSCs 的形态学特征。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 55,
        "chunk": "# 2.2.3.3 BMSCs 表面抗原鉴定  \n\n通过流式细胞术对分离获得的 H-BMSCs 和 OP-BMSCs 的表面抗原进行检测。结果显示获得的细胞均表现为 CD90 呈阳性表达，CD34 和 CD45 呈阴性表  \n\n达，两组细胞均符合 BMSCs 典型的细胞表面抗原表达特点（图 2.5）。  \n\n![](images/207c7f5d017923800cca98f61a95027ace0df158f17c42eef7aedb25bcf58119.jpg)  \n图2.5 （A）流式细胞术鉴定H-BMSCs 表型抗原；（B）流式细胞术鉴定OP-BMSCs表型抗原。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 56,
        "chunk": "# 2.2.3.4 BMSCs 三向分化鉴定  \n\n如图 2.6 所示，获得的 H-BMSCs 与 OP-BMSCs 经过成骨诱导分化 14 天后，碱性磷酸酶染色可见胞质中出现深染的黑褐色团块，显示细胞经成骨诱导后往成骨方向分化；甲苯胺蓝染色显示胞质被染为紫红色，表明 BMSCs 经成软骨诱导培养后可向成软骨方向分化；油红 O 染色可见细胞中出现红色脂滴且有融合迹象，证明BMSCs 经成脂诱导分化后可向成脂肪方向分化。且相较于 H-BMSCs，OP-BMSCs 在碱性磷酸酶染色和甲苯胺蓝染色中细胞阳性着色较浅，而油红 O染色阳性脂滴形成更多。  \n\n![](images/44580f05195489d8fab37deb03201fa98ac5b3cd02e325f13b5324d99d552b98.jpg)  \n图2.6 碱性磷酸酶染色、甲苯胺蓝染色和油红 O 染色分别验证H-BMSCs 和OP-BMSCs 的成骨、成软骨和成脂三向分化能力。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 57,
        "chunk": "# 2.2.4 讨论  \n\n骨质疏松症是主要由于骨量降低、骨的微观结构破坏和脆性增加，导致患者容易出现骨折的一种全身性、代谢性骨病。其中，绝经后骨质疏松一般发生在女性绝经后 5-10 年，这是由于女性绝经后雌激素在体内水平急剧下降，引起骨含量减少和钙成分吸收障碍，致骨代谢出现异常而出现骨质疏松表现 [186, 187]。双侧卵巢切除术是制备骨质疏松动物模型的经典方法 [188-190]。在本研究中，双侧卵巢切除术后 10 个月，可见白兔血清雌激素水平明显下降，骨密度和骨量显著低下，证明成功地建立了骨质疏松动物模型。  \n\nBMSCs 是一类具有自我更新和多向分化潜能的种子细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和神经相关细胞等。BMSCs 广泛存在于骨髓腔中，对骨损伤后的修复起至关重要的作用 [191, 192]。骨质疏松患者骨折或者关节置换术后骨再生和骨整合能力不足，可能是部分由于 BMSCs 低下的自噬能力导致成骨分化不足，趋向于成脂分化而造成 [193, 194]。因此，我们使用收集健康白兔与骨质疏松白兔骨髓血中中的 BMSCs 进行分离、培养，用于后续细胞学研究。BMSCs 的提取过程严格遵循无菌原则。由于骨髓血中存在大量的红细胞和脂肪颗粒，如使用传统的贴壁法，细胞在培养皿上贴附效率不高，且考虑到骨质疏松模型制备周期较长、来源不易，我们采用密度梯度离心法保证 BMSCs 的提取效率，此方法能将骨髓血中的各成分高效地分离 [195]。随后，我们通过对获得的细胞形态观察、细胞表面标志物鉴定和多向诱导分化来确定获得的细胞确为BMSCs。此外，在多向诱导分化实验中可见相较于 H-BMSCs，OP-BMSCs 在碱性磷酸酶染色中细胞阳性着色较浅，而油红 O 染色阳性脂滴更多且融合，反应OP-BMSCs 成骨分化能力减弱而趋向于成脂分化，与既往文献结论相同 [45, 196]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 58,
        "chunk": "# 2.2.5 小结  \n\n本章节通过双侧卵巢切除法，在手术 10 个月后对血清雌激素水平测定和Micro-CT 定量分析骨量验证成功制备了骨质疏松动物模型。随后，使用密度梯度离心法获取种子细胞并培养、扩增，并通过对细胞的形态观察、表面标志物鉴定和多向诱导分化来确定获得的细胞确为 BMSCs。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 59,
        "chunk": "# 2.3 超声介导雷帕霉素递送激活 OP-BMSCs 自噬",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 60,
        "chunk": "# 2.3.1 实验仪器与材料  \n\n2.3.1.1 实验仪器   \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>超声电导仪</td><td>北京诺亚同舟医疗技术有限公司</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>超净操作台</td><td>美国Airtech公司</td></tr><tr><td>蛋白电泳及转膜仪</td><td>中国 Tanon 公司</td></tr><tr><td>Clinx Science Instruments</td><td>上海勤翔科学仪器有限公司</td></tr><tr><td>高效液相色谱-串联质谱仪</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>日本JEOL公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他仪器同 2.2.1.1。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 61,
        "chunk": "# 2.3.1.2 主要试剂  \n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>美国Invitrogen 公司</td></tr><tr><td>蛋白裂解液</td><td>北京全式金生物技术有限公司</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>北京全式金生物技术有限公司</td></tr><tr><td>5x蛋白上样缓冲液</td><td>北京鼎国昌盛生物技术有限公司</td></tr><tr><td>BCA蛋白浓度测定试剂盒</td><td>上海碧云天生物技术有限公司,</td></tr><tr><td>Protein leader</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>美国Millipore公司</td></tr><tr><td>SDS-PAGE凝胶配制试剂盒</td><td>北京鼎国昌盛生物技术有限公司</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>北京鼎国昌盛生物技术有限公司</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td></tr><tr><td>目的蛋白一抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>标记二抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>Ad-McHery-GFP/LC3B</td><td>上海碧云天生物技术有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>雷帕霉素</td><td>美国Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>FITC-雷帕霉素</td><td>西安齐岳生物科技有限公司</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>美国 Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>酸</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他试剂同 2.2.1.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 62,
        "chunk": "# 2.3.1.3 溶液配制  \n\n1）电泳缓冲液（1L）  \n\nSDS 1.0 g 甘氨酸 14.4 g Tris 3.0 g  \n\n2）电转缓冲液（1L）  \n\n甲醛 200 ml甘氨酸 14.4 gTris 3.0 g  \n\n3）TBST 溶液（ $500\\mathrm{ml}\\cdot$ ）  \n\nNaCl 4.09 g Tris 0.605 g Tween 20 0.5 ml  \n\n4）Western Blot 封闭液： $5\\%$ 脱脂奶粉  \n\n称取 1g 脱脂奶粉加到 $20~\\mathrm{ml}$ TBST 溶液中，于摇床上摇匀。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 63,
        "chunk": "# 2.3.1.4 实验动物  \n\n新西兰大耳白兔：由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 64,
        "chunk": "# 2.3.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 65,
        "chunk": "# 2.3.2.1 经皮超声介导雷帕霉素递送效率检测  \n\n1）体外超声导药效率分析：取 $9.14~\\upmu\\mathrm{g}$ 雷帕霉素充分溶解于 $10~\\mathrm{ml}$ 低糖DMEM 中，配置出浓度为 $1000~\\mathrm{{nM}}$ 雷帕霉素溶液。将明胶海绵裁剪为直径为 1cm 的圆片状，并将 $200~\\upmu\\mathrm{l}$ 雷帕霉素溶液添加到明胶海绵块中。将明胶海绵与超声发射探头紧密贴合，然后用新鲜兔皮外层包裹明胶海绵与探头，兔皮内层朝向含有 $2~\\mathrm{ml}$ 溶液的孔板。设置超声电导仪的频率为 $30~\\mathrm{kHz}$ ，强度为 $45\\ \\mathrm{W/cm}^{2}$ ，每隔 $2\\mathrm{min}$ 收集孔板中的液体，并用新鲜溶液等量替换，导药结束后用高效液相色谱-串联质谱仪检测各时间点孔板中雷帕霉素的浓度。  \n\n2）体内超声导药效率分析：将 3D 打印微孔钛合金支架植入兔左侧股骨远端外侧髁（具体手术操作步骤见 2.5.2.1 章节）。同上，配制浓度为 $1000~\\mathrm{{nM}}$ 的FITC-雷帕霉素。然后将浸有 $200~\\upmu\\mathrm{l}$ 药液的明胶海绵稳定放置在左侧股骨远端外侧髁皮肤与超声发射器头之间进行药物递送，设置超声电导仪的频率为 $30\\mathrm{kHz}$ ，强度为 $45\\mathrm{W/cm}^{2}$ ，时间为 $10\\mathrm{min}$ 。作为对照，Con 组未接受超声导药处理，UI组只接受不含雷帕霉素的超声处理。导药结束后，过量麻醉法处死动物，收集左膝外侧髁软组织及股骨进行切片，在荧光显微镜下观察 FITC-雷帕霉素在组织内的分布情况。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 66,
        "chunk": "# 2.3.2.2 各组细胞的 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的蛋白水平检测  \n\n通过 Western Blot 检测细胞中 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的蛋白表达水平，评估细胞的自噬水平，具体步骤如下：  \n\n1）H-BMSCs 和 OP-BMSCs 以 $1\\times10^{4}/$ 每孔种植在 12 孔板中，H-BMSCs 不接受任何处理（Health 组），OP-BMSCs 不接受任何处理（OP 组），OP-BMSCs接受不含雷帕霉素的超声处理（OP-UI 组），OP-BMSCs 接受含雷帕霉素的超声导药处理（OP-UIRa 组）。超声电导仪工作参数：频率为 $30\\mathrm{kHz}$ ，强度为 $45\\mathrm{W}/\\mathrm{cm}^{2}$ ，时间为 $10\\mathrm{min}/$ 每天。  \n\n2）将接受不同处理 3 天后的细胞用PBS 轻轻冲洗两遍，加入 $1\\mathrm{mlPBS}$ ，将培养板置于冰上，用细胞刮刀刮取贴壁细胞，并将液体转移至 $1.5~\\mathrm{ml}$ EP 管中，离心（ $\\cdot5\\mathrm{min}$ ， $3000\\mathrm{rpm}\\rrangle$ ），弃上清收集细胞沉淀。加入 $160\\upmu\\mathrm{l}$ 含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，吹打沉淀后振荡涡旋器振荡 15s，静置 $10\\mathrm{min}$ ，重复上述步骤 3 次，离心（10min， $12000\\mathrm{rpm}\\therefore$ ），收集上清。 $160\\upmu\\mathrm{l}$ 上清液中加入 $40\\upmu\\updownarrow5\\times$ 蛋白上样缓冲液， $100^{\\circ}\\mathrm{C}$ 水浴加热 $5\\mathrm{min}$ ，置于冰上冷却，保存于- $-20^{\\circ}\\mathrm{C}$ 备用。  \n\n3）BCA 法测定总蛋白浓度：取 $2~\\upmu\\upmu$ 蛋白样品，并加入 $18~\\upmu\\upmu$ 双蒸水稀释。根据 BCA 试剂盒说明书，将 A、B 溶液以 1：50 的比例混合均匀，每孔 $200~\\upmu\\mathrm{l}$ 混合液；在 96 孔板中加入 $200~\\upmu\\mathrm{l}$ 混合液，以及 $20~\\upmu\\mathrm{l}$ 蛋白标准品和待测蛋白样品，低速振荡 $30\\mathrm{s}$ ， $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 孵育 $30\\mathrm{min}$ ，用酶标仪在 $594\\mathrm{nm}$ 测定吸光光度值并记录结果。根据上述结果绘制标准曲线并计算相应待测样品的蛋白浓度。  \n\n4）Western Blot 检测：根据目的蛋白分子量大小配制 $10\\%$ 的 SDS 凝胶，每个样品上样量为 $15~{\\upmu\\mathrm{g}}$ 总蛋白，根据蛋白浓度计算后使用 $1\\times$ 蛋白上样缓冲液补齐体系使上样体积一致。 $80\\mathrm{V}$ 恒压电泳 $30\\mathrm{min}$ 左右至蛋白跑至分离胶，再以 $120\\mathrm{V}$ 恒压继续电泳至目的蛋白分离。使用湿性电转法将凝胶上的蛋白转至甲醛激活的PVDF 膜上，恒流法电转（电流 $200~\\mathrm{{mA}}$ ，电压不低于 80V）。取出电转结束的PVDF 膜， $5\\%$ 的脱脂奶粉室温下于摇床上封闭 1 h，TBST 洗膜3 次，每次 5 min，加入一抗工作液 $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 孵育过夜（一抗稀释浓度分别为： $\\upbeta$ -actin 1:1000，mTOR 1：200、LC3Ⅱ 1:100、LC3Ⅰ 1:100 和 P62 1:200）。第二天 TBST 洗膜 3 次，每次$10\\mathrm{min}$ ，加入 HRP 标记的相应二抗工作液（稀释浓度均为：1：500），于摇床上室温孵育 $45~\\mathrm{min}$ 。TBST 洗膜 3 次，每次 $5~\\mathrm{min}$ ，加入 ECL 显影液利用 ClinxScience Instruments 曝光，保存图片，并使用 Image J 软件计算各条带灰度值，以$\\upbeta$ -actin 为内参计算各组蛋白的表达量。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 67,
        "chunk": "# 2.3.2.3 Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞  \n\n1）为了分析不同条件下的自噬通量，将 H-BMSCs 和 OP-BMSCs 以 $1\\times10^{4}/$ 每孔种植在在6 孔培养板上，并在达到 $50\\%-60\\%$ 的融合时进行感染；2）用 PBS 洗涤三次后，用浓度为 10 摩尔的表达 mCherry-GFP-LC3B 融合蛋白的腺病毒（Ad-McHery-GFP/LC3B）感染细胞。 $24\\mathrm{h}$ 后， $4\\%$ 多聚甲醛固定，PBS 洗涤 3 遍，通过荧光显微镜观察 mCherry 和 GFP 的表达来显示自噬体和自噬溶酶体的变化",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 68,
        "chunk": "# 2.3.2.4 透射电子显微镜观察细胞内自噬表达  \n\n1）同 2.3.2.2 步骤 1）处理各组细胞3 天后，收集细胞；  \n\n2) $2.5\\%$ 戊二醛 $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 固定 2-4h；  \n\n3) 等渗： $1{\\times}\\mathrm{PBS}$ 液置换 $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 过夜；  \n\n4) $1\\%$ 锇酸 $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 固定2h： $1\\%$ 锇酸的配制：去离子水进行配制 $2\\%$ 锇酸工作液静置3 天充分溶解，再用 $1{\\times}\\mathrm{PBS}$ 稀释到浓度为 $1\\%$ 锇酸染液（ $(2\\%$ 的锇酸为原液）；  \n\n5) $1{\\times}\\mathrm{PBS}$ 漂洗， $5\\operatorname*{min}^{\\times3}$ 次；  \n\n6) 酒精和丙酮脱水： $50\\%$ 酒精（ $20\\ \\mathrm{min}\\times1$ 次） $\\rightarrow70\\%$ 酒精（ $20\\ \\mathrm{min}{\\times}1$ 次）$\\rightarrow90\\%$ 酒精（ $20\\mathrm{min}{\\times}1$ 次） $\\rightarrow100\\%$ 酒精（ $20\\ \\mathrm{min}{\\times}1$ 次） $\\rightarrow100\\%$ 丙酮（ $30\\ \\mathrm{min}\\times2$ 次)；  \n7). 包埋剂浸透（烤灯复温， $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 浸透）：环氧树脂：丙酮 $|=1{:}1$ （ $60\\mathrm{{min}\\times1}$ 次）$\\rightarrow$ 环氧树脂：丙酮 $=2{:}1$ （ $60\\mathrm{min}\\mathrm{\\times}1$ 次） $\\rightarrow$ 环氧树脂：丙酮 $|=3{:}1$ （ $60\\mathrm{min}{\\times}1$ 次）；  \n8) 纯包埋剂包埋： $40^{\\circ}\\mathrm{C}/2\\mathrm{h}{\\rightarrow}65^{\\circ}\\mathrm{C}/3\\mathrm{h}{\\rightarrow}80^{\\circ}\\mathrm{C}/15\\mathrm{h}$ ；  \n9) 半薄切片定位： 制备半薄切片，甲苯胺蓝染色，进行目标位置；  \n10) 超薄切片制备： $70\\mathrm{nm}$ 超薄切片；  \n11) 染色： $1\\%$ 乙酸铀酰染色 $10\\mathrm{min}$ 后，去离子水洗 $10\\mathrm{min}$ ； $1\\%$ 柠檬酸铅染$10\\mathrm{min}$ ，去离子水洗 $10\\mathrm{min}$ ；  \n12) 透射电镜拍照。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 69,
        "chunk": "# 2.3.2.5 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 70,
        "chunk": "# 2.3.3 实验结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 71,
        "chunk": "# 2.3.3.1 经皮超声介导雷帕霉素递送效率  \n\n为明确超声导药能够顺利通过皮肤进入靶部位，首先构建模拟体外超声导药体系（图 2.7A）。如图 2.7B 显示，超声电导仪工作 $10~\\mathrm{min}$ 后，培养基中雷帕霉素的浓度为 $98.33\\pm3.09\\mathrm{nM}$ ，几乎将明胶海绵中的雷帕霉素完全透皮释放。随后，我们使用 FITC 标记的雷帕霉素对植入微孔支架后的兔模型进行超声导药（图2.7C）。如图 2.7D 显示，在 UIRa 组中可以观察到皮肤、肌肉组织以及微孔支架孔隙中布满绿色荧光标记的雷帕霉素，表明本实验中使用的经皮超声导药的策略能够成功地将雷帕霉素递送至靶部位。  \n\n![](images/3925108ef166de05760d8d1e6679b0a0e7706edbc6a060f0c3d9a5cc48a19905.jpg)  \n图 2.7（A）体外超声介导雷帕霉素递送模式图；（B）体外雷帕霉素浓度与超声电导时间的关系；（C）体内超声介导雷帕霉素递送模式图；（D）体内皮肤、肌肉及植入骨组织的微孔支架孔隙中 FITC-雷帕霉素的荧光分布。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 72,
        "chunk": "# 2.3.3.2 自噬关键蛋白 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的表达水平  \n\n为了确认自噬相关蛋白在超声电导雷帕霉素后的变化，我们利用 WesternBlot 技术检测了经过不同处理后的细胞中这些的蛋白表达水平（图 2.8A）。如图2.8B 定量分析显示，与 H-BMSCs 相比，OP 和 OP-UI 中的 mTOR 和 P62 表达水平增高，LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降，表明 OP-BMSCs 的自噬受到抑制，而单纯使用不含雷帕霉素的超声电导作用并不会逆转这种趋势。而通过递送 mTOR 抑制剂雷帕霉素可以使OP-BMSCs 的中的mTOR 蛋白表达受到抑制，从而提高 LC3Ⅱ/Ⅰ比值和减少P62 表达，激活细胞自噬。  \n\n![](images/01aaa586a4d9a36e28e793f2badfdf4d67d485ea630b3b5538b79d3cf438543b.jpg)  \n图 2.8（A）Western Blot 显影条带及相应分子量， $\\upbeta$ -actin 为内参分子；（B）各组蛋白条带灰度值统计结果（ $^{\\cdot}\\ast_{p}<0.05$ ; $**_{p}<0.01)$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 73,
        "chunk": "# 2.3.3.3 Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞观察自噬通量变化  \n\n如图 2.9A 所示，Ad-mCherry-GFP-LC3B 感染细胞后，mCherry 和 GFP 荧光融合形成的黄色斑点表明自噬体（白色箭头），其未与溶酶体融合。绿色荧光蛋白可以在酸性环境中降解，因此红色斑点代表与溶酶体融合的自噬体（红色箭头）。在健康组中观察到一定量的黄点和红点，显示 H-BMSCs 中自噬正常活性水平。然而，OP 和OP-UI 组中的红点较少，表明自噬通量减少。相反，在 OP-UIRa 组中，红色斑点（与黄色斑点相比）增加，表明自噬通量被激活。  \n\n此外，透射电镜观察显示，与 OP 和 OP-UI 组相比，Health 组和 OP-UIRa 组的自噬泡数量增加（图 2.9B）。这些结果证实，相比于 H-BMSCs，OP-BMSCs 自噬活性降低，而超声介导的雷帕霉素递送可使OP-BMSCs 受损的自噬活性上调，并接近至健康状态。  \n\n![](images/f5552c327482f591c6f1a0872a615245b243ff15e4261683eb87dbdd3c77b562.jpg)  \n图 2.9（A）Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞，白色箭头表示自噬体，红色箭头表示自噬溶酶体；（B）透射电镜观察细胞内自噬泡形成。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 74,
        "chunk": "# 2.3.4 讨论  \n\n本实验所采用的超声电导仪（NAVA-01CSSY）由北京诺亚同舟医疗技术有限公司提供，该经皮超声导药系统是一种以一定参数范围的超声波为主要动力，能够实现向靶部位无创经皮递送药物的专用医学设备，利用超低频超声波的聚焦辐射压产生足够的冲击力，使机械能转化为强大而可控的动能，将递送的药物透过皮肤靶向进入体内治疗部位，达到提高局部组织和细胞内药物浓度的效果。其具体机制可分为人工生物通道的建立和强力定向驱动。其中人工生物通道的建立机制包括：1）、电致孔技术：是采用一种特定的瞬时电脉冲，改变组织膜和细胞膜脂质颗粒的排列，使之有序化，形成药物通透的水性孔道。密集的孔道在一定范围内形成药物进入体内的高通透区。2）、超声空化技术：利用超声波的空化作用，可使皮肤细胞膜、组织膜形成和扩大已形成的生物孔道，大孔径可达 $250\\mathrm{nm}$ ，孔道可维持时间长达两小时。此外，强力定向驱动的机制包括：1）、超声波对流转运作用与辐射压作用使药物粒子和分子获得定向转运的动能，沿声波传播方向运动。2）、现代离子导入在电场作用下，离子型药物活化，按电趋向性定向泳动。3）、病变组织药物浸润，促进药物自细胞外向细胞内转运 [197-200]。因此，在设置超声电导仪参数频率为 $30\\mathrm{kHz}$ ，强度为 $45\\mathrm{W}/\\mathrm{cm}^{2}$ ，可以很好的将负载的药物经皮分散到溶液中；在该参数下通过 $10~\\mathrm{min}$ 体内超声电导，可以很好的将雷帕霉素递送至皮下软组织及植入股骨髁内的微孔支架内部，这种成功经皮递送雷帕霉素到靶部位为后续的研究提供了理论基础。  \n\nBMSCs 具有自我更新和多向分化的潜能，在假体植入后的骨再生和骨整合中发挥关键作用 [201-203]。基线水平的自噬活性可以维持干细胞的干性和分化能力。然而，自噬的失衡导致细胞衰老、数量减少和功能受损 [204-206]。在骨质疏松状态下，OP-BMSCs 的自噬水平低下，可能是骨损伤后成骨能力不足的重要原因[45]。自噬可以通过多种信号途径进行调节，其中一个关键分子是雷帕霉素的靶标（Target of Rapamycin, TOR），它可以感知细胞内外的各种信号变化，并调节自噬水平以响应外部环境的刺激。先前的研究表明，mTOR 是哺乳动物 TOR 的同系物，可以调节细胞周期、生长和增殖 [207]。绝经后骨质疏松哺乳动物 BMSCs的自噬水平降低，然而，雷帕霉素抑制关键靶点 mTOR 可以恢复自噬水平，增强OP-BMSCs 的增殖和成骨分化潜能，并改善体内的骨微观结构 [45]。雷帕霉素作为经典的自噬诱导剂，可激活细胞的自噬活性 [52, 53]。既往研究显示通过雷帕霉素激活细胞自噬，可以部分改善骨质疏松状态下的成骨不良，增加骨量 [54, 55]。这些结果表明，自噬调节 BMSCs 的再生功能并控制骨质疏松症的发展，而通过雷帕霉素激活自噬可能为增强骨质疏松状态下的假体界面骨整合提供有效的治疗策略。  \n\n在自噬形成时，胞浆型 LC3（即LC3-I）会被酶解掉一小段多肽，从而形成  \n\n（自噬体）膜型（即 LC3-II），在此过程中，LC3-II 比例增加代表自噬启动；而可通过自噬来降解得 P62 可反映自噬发生的强度。在自噬过程中，LC3 II 升高的同时伴随 P62 水平下降，则可证明自噬流通畅；若 LC3II 升高的同时伴随 P62也升高，则意味着自噬起始阶段正常，但下游不通畅，吞噬体和溶酶体不能顺利地融合 [208]。除此之外，通过 Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞检测观察自噬通量情况，由于 GFP 在酸性环境中可被降解，红绿荧光合并后出现的黄色斑点即表示未与溶酶体融合的自噬体，结合后显示的红色斑点代表可将绿色荧光淬灭的自噬溶酶体。如自噬通常、吞噬体和溶酶体能正常融合，则显示未红色荧光多于黄色荧光；若自噬下游受阻，导致吞噬体和溶酶体不能正常进行融合，则主要显示为黄色荧光。我们通过一系列检测证明 OP-BMSCs 低下的自噬水平可以通过雷帕霉素的递送而得到纠正，且几乎可以恢复到正常状态下的水平。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 75,
        "chunk": "# 2.3.5 小结  \n\n本实验所采用的超声电导仪可以成功地将雷帕霉素递送至靶部位，并通过Western Blot 法检测自噬通路关键蛋白、Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染和透射电镜观察自噬体，证明这种策略可以激活细胞自噬，纠正OP-BMSCs 低下的自噬水平，甚至恢复到正常状态下的水平。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 76,
        "chunk": "# 2.4 超声介导雷帕霉素递送调节 OP-BMSCs 功能",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 77,
        "chunk": "# 2.4.1 实验仪器与材料",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 78,
        "chunk": "# 2.4.1.1 实验仪器  \n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>超声电导仪</td><td>北京诺亚同舟医疗技术有限公司</td></tr><tr><td>超净操作台</td><td>美国Airtech公司</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr><tr><td>Transwell 孔板</td><td>美国Corning 公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>PCR板 瑞士Roche 公司</td></tr><tr><td>LightCycler 480 瑞士Roche 公司</td></tr><tr><td>分光光度计 NanoDrop 2000 美国Thermo 公司</td></tr></table></body></html>  \n\n其他仪器同 2.2.1.1。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 79,
        "chunk": "# 2.4.1.2 主要试剂  \n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>美国 Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>CCK-8试剂盒</td><td>上海贝博生物科技有限公司</td></tr><tr><td>Calcein-AM/PI染色试剂盒</td><td>上海贝博生物科技有限公司</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>Phalloidin-鬼笔环肽染色试剂盒</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>油红〇染色液</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>总 RNA提取试剂盒</td><td>上海Promega 生物产品有限公司</td></tr><tr><td>RNA逆转录试剂盒</td><td>日本 Takara 公司</td></tr><tr><td>SYBR Green Master mix</td><td>瑞士Roche 公司</td></tr><tr><td>qPCR引物</td><td>上海生工生物有限公司</td></tr><tr><td>RT-qPCR 试剂盒</td><td>北京全式金生物技术有限公司</td></tr><tr><td>茜素红染液</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>氯化十六烷基吡啶</td><td>美国 Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>Runx-2 单克隆抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>ALP 单克隆抗体</td><td>美国Abcamy公司</td></tr><tr><td>OCN单克隆抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>OPN单克隆抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>山羊抗兔Cy3荧光二抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 AlexaFluor?488 荧光二抗</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>北京索莱宝生物科技有限公司</td></tr><tr><td>含 DAPI 抗淬灭封片剂</td><td>美国Vector 公司</td></tr></table></body></html>  \n\n其他试剂同 2.2.1.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 80,
        "chunk": "# 2.4.1.3 溶液配制",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 81,
        "chunk": "# 1）免疫荧光封闭液  \n\n在 $20~\\mathrm{ml}$ PBS 中加入 $0.2\\mathrm{g}\\mathrm{BSA}$ ，置于水平摇床室温摇 $20\\mathrm{{min}}$ ，再加入 $200{\\mathrm{ul}}$ 山羊血清封闭液并混匀， $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 保存。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 82,
        "chunk": "# 2.4.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 83,
        "chunk": "# 2.4.2.1 CCK-8 法测试细胞增殖情况  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在 12 孔板中，待细胞贴壁后，给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤 1）。在第 1，4 和 7 天时使用CCK-8 试剂盒检测细胞增殖情况，具体操作如下：  \n\n1）在预定检测时间点，更换培养基后加入 $10\\%$ 体积的CCK-8 反应液；2）将 12 孔板放入 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 、 $5\\%\\mathrm{CO}_{2}$ 的孵箱中避光孵育 $2\\mathrm{h}$ ；3）取出 12 孔板，在每个样品中吸取 $100~\\upmu\\mathrm{l}$ 的液体转移到96 孔板；4）转移结束后，迅速将 96 孔板放置在酶标仪内检测各组 OD 值，检测波长为 $450\\mathrm{nm}$ ；5）收集所得数据，进行统计分析。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 84,
        "chunk": "# 2.4.2.2 Calcein-AM/PI 细胞活死染色  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在 12 孔板中，待细胞贴壁后，给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤 1）。在第3 天时使用 Calcein-AM/PI 试剂盒检测细胞活死情况，具体操作如下：  \n1）配制染色工作液：Calcein-AM 工作液： $0.5\\operatorname{ml}\\mathrm{C}+10\\operatorname{ul}\\mathrm{A}+4.5\\operatorname{ml}$ 无菌去离子水。PI 工作液： $0.5\\mathrm{ml}\\mathrm{C}+5\\mathrm{ul}\\mathrm{B}+4.5\\mathrm{ml}$ 无菌去离子水；  \n2）细胞固定：吸取培养基， $4\\%$ 多聚甲醛溶液固定 $10~\\mathrm{min}$ ，PBS 清洗 3 次；  \n3）每孔加入 $0.5{\\mathrm{ml}}$ Calcein-AM 工作液避光孵育 $15\\mathrm{min}$ ，随后避光环境下加入PI 工作液 $0.5{\\mathrm{ml}}$ 继续避光孵育 $5\\mathrm{min}$ ；  \n4）迅速转移到暗室中，荧光显微镜下观察并拍照；  \n5）收集所得图片，Image J 分析细胞存活率。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 85,
        "chunk": "# 2.4.2.3 Phalloidin-鬼笔环肽染色  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在 12 孔板中，待细胞贴壁后，给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤 1）。在第 3 天时使用Phalloidin-鬼笔环肽试剂盒染色观察细胞形态，具体操作如下：  \n\n1）去除培养液，将细胞用 PBS 清洗3 次， $4\\%$ 多聚甲醛在室温下固定 $10\\mathrm{min}$ ；  \n2）去除固定液，PBS 清洗细胞3 次；  \n3）室温下， $0.5\\%$ 的 triton X-100 对细胞进行透化处理 $5\\mathrm{min}$ ，再次用PBS 清洗细胞3 次；  \n4）吸取 $400~\\upmu\\mathrm{l}$ 配置好的 Phalloidin-鬼笔环肽工作液加入孔板中，室温避光孵育 $30\\mathrm{min}$ ，PBS 清洗 3 次；  \n5）吸取 $400~\\upmu\\mathrm{l}$ 的DAPI 溶液（浓度 $100~\\mathrm{{nM}}$ ）对细胞核复染 $2~\\mathrm{min}$ ；  \n\n6）在荧光显微镜下进行观察并拍照，Image J 分析细胞荧光强度。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 86,
        "chunk": "# 2.4.2.4 细胞划痕实验  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在 24 孔板中，待细胞融合到 $85\\%$ 以上后，用$200\\upmu\\mathrm{l}$ 枪头在孔板中央画一条直线，PBS 冲洗数次，去除漂浮细胞。随后给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤 1）。在第 $0\\mathrm{{h}}$ 和 $24\\mathrm{~h~}$ 时使用Calcein-AM/PI 试剂盒染色，具体操作如章节 2.4.2.2。根据图像计算细胞迁移率。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 87,
        "chunk": "# 2.4.2.5 Transwell 细胞迁移实验  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在 Transwell 小室中，给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤 1）。在 $24\\mathrm{~h~}$ 后取出 Transwell 小室，弃培养液，无钙 PBS 清洗 2 次，甲醇固定 $30~\\mathrm{min}$ ，适当风干小室； $0.1\\%$ 结晶紫染色 $20\\mathrm{min}$ ，用棉签轻轻擦去上层未迁移细胞，显微镜下随机观察 5 个视野，计数。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 88,
        "chunk": "# 2.4.2.6 茜素红染色  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在 12 孔板中，待细胞贴壁后，更换成骨诱导培养基，给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤 1）。  \n\n在成骨诱导后的第 7 天和第14 天进行茜素红染色，具体步骤如下：  \n\n1）去除培养基， $4\\%$ 多聚甲醛固定 $15\\mathrm{min}$ 后去除固定液，PBS 清洗3 次；2）将 PBS 完全吸净后，加入 $2\\%$ 茜素红 S 染色液 $0.5~\\mathrm{ml}$ ，染色 $15~\\mathrm{min}$ ，去除染色液，PBS 洗涤 3 次；3）然后将染色好的细胞样品拍照，并放置在显微镜下进行观察；4）为半定量分析钙结节，孔板中加入氯化十六烷基吡啶 $\\mathrm{~1~ml}$ ，并将孔板置于摇床上摇晃过夜，充分溶解沉积的钙结节。吸取孔中上清液转移到 96 孔板中，使用酶标仪在 $570\\mathrm{nm}$ 波长处检测样品吸光度。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 89,
        "chunk": "# 2.4.2.7 RT-qPCR  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在 12 孔板中，待细胞贴壁后换液，使用成骨诱导培养基，给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤1）。在成骨诱导 7 天和 14 天后进行 PCR 检测分析细胞中 Runx-2、ALP、OCN和OPN 的基因表达情况，具体步骤如下：  \n\n1）总 RNA 的提取：去除培养基，PBS 轻轻冲洗细胞2 遍，用胰酶消化至细胞变圆但未浮起时去除胰酶，加入 $1~\\mathrm{ml}$ PBS 吹打、重悬细胞，收集细胞转移到$1.5\\mathrm{ml}$ 无核酸酶 EP 管中，离心（ ${3000}\\mathrm{rpm}$ ，5 min）弃 PBS。根据 Promega 总 RNA提取试剂盒的说明书，加入 $300\\upmu\\mathrm{l}$ 裂解液并反复吹打细胞沉淀 5 次左右，至肉眼无可见细胞沉淀，室温裂解 $15\\mathrm{min}$ 后加入中和液 $300\\upmu\\mathrm{l}$ ，吹打3 次混匀，室温放置 $5~\\mathrm{min}$ 。为提高RNA 获得率，可于 $70^{\\circ}\\mathrm{C}$ 环境下加热 $3~\\mathrm{min}$ 后离心（ $12000~\\mathrm{g}$ ，5 min）；  \n\n2）总 RNA 浓度测量：用 NanoDrop 2000 分光光度计检验各组 RNA 样品的浓度和纯度。若 A260/A280 比值处于 1.9-2.1 之间时认为 RNA 样品为无蛋白质污染，可用于后续实验，所有 RNA 样品- $.80^{\\circ}\\mathrm{C}$ 保存待用；  \n\n3）逆转录合成 cDNA：参考Takara 逆转录试剂盒的使用说明，每个 RNA 样品以 $500~\\mathrm{ng}$ 的总质量进行逆转录，加入无核酸酶水和其它预混试剂至总体系为$20~\\upmu\\mathrm{l}$ ，加入 $0.2~\\mathrm{ml}$ 无核酸酶 EP 管，置于 PCR 热循环仪进行逆转录反应，反应条件为： $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ ， $15\\mathrm{min}$ ； $85^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，5 s； $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，降温，获得的逆转录产物- $\\cdot20^{\\circ}\\mathrm{C}$ 保存待用；  \n\n4）RT-qPCR: 配制 qPCR 反应体系 $20\\upmu\\mathrm{l}$ ，包括 SYBR Green Mastermix $10\\upmu\\mathrm{l}$ ，  \n\n$10\\ \\mathrm{\\textmumol{/L}}$ 上下游混合物 $1~\\upmu\\mathrm{l}$ ， $\\mathrm{\\ddH}_{2}\\mathrm{O}~8~\\upmu\\mathrm{l}$ 和 $\\mathrm{cDNA}1\\upmu\\mathrm{l}{\\mathrm{~}}_{}$ 。将上述反应体系转移入PCR 专用96 孔板中，每个样品每种引物设置 3 个复孔，每个样品设置2 个空白对照孔（将cDNA 更换为 $\\mathrm{\\dd{d}H_{2}O}\\rangle$ ），封膜，离心（ $2500\\mathrm{rpm}$ ，3 min）。将 PCR板放置入罗氏LightCycler480 仪器进行实时荧光定量反应。反应条件如下：第一步， $95^{\\circ}\\mathrm{C}$ ， $10\\mathrm{min}$ （聚合酶激活）；第二步， $95^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，15 s（DNA 变性）， $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，1min（DNA 退火与延伸），循环 40 次此步骤；第三步，添加溶解曲线， $95^{\\circ}\\mathrm{C}{-}15$ s， $60^{\\circ}\\mathrm{C}{-}30~\\mathrm{s}$ ， $95^{\\circ}\\mathrm{C}{-}15\\ \\mathrm{s}$ ；第四步，冷却至 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 。收集结果并在 LightCycler 480软件进行数据分析，只有当每个样品的溶解曲线显示为单峰且在峰值出现前平坦的Ct 值可纳入至后续的计算。采用 $2^{-\\Delta\\Delta\\mathrm{Ct}}$ 计算方法，各引物信息见表 2.1，以 ${\\mathfrak{\\beta}}.$ -actin 为内参。  \n\n表2.1 各基因引物信息  \n\n\n<html><body><table><tr><td>Gene subtype</td><td>Oligonucleotide Primers (5'-3\")</td></tr><tr><td>ALP</td><td>F: 5'-ATC GGA CCC TGC CTT ACC-3'</td></tr><tr><td>Runx-2</td><td>R: 5'-CTC TTG GGC TTG CTG TCG-3' F: 5'-ACTACCAGCCACCGAGACCA-3'</td></tr><tr><td>OCN</td><td>R: 5'ACTGCTTGCAGCCTTAAATGACTCT-3' F: 5'-AGCCACCGAGACACCATGAGA-3'</td></tr><tr><td>OPN</td><td>R: 5'-AGCCACCGAGACACCATGAGA-3'</td></tr><tr><td></td><td>F: 5'-GCTAAACCCTGACCCATCT-3' R: 5'-CGTCGGATTCATTGGAGT-3'</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>F: 5'- GTATGATTCCACCCACGGCA-3'</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 90,
        "chunk": "# 2.4.2.8 免疫荧光染色  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在 12 孔板中，待细胞贴壁后，更换成骨诱导培养基，给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤 1）。在成骨诱导 14 天后进行免疫荧光染色分析细胞中 Runx-2、ALP、OCN 和 OPN的蛋白表达情况，具体步骤如下：  \n\n1）细胞固定和穿孔：弃去培养基，PBS 轻轻冲洗2 遍，每孔中加入 $4\\%$ 多聚甲醛 $\\mathrm{1ml}$ 于室温下固定 $15\\mathrm{min}$ ，去除固定液后 PBS 洗3 次，每孔加入 $0.5\\%$ Triton$\\mathrm{X}{-}100\\ 1\\ \\mathrm{ml}$ ，室温透化 $15\\mathrm{min}$ ，PBS 洗 3 次；  \n\n2）封闭：样品置于湿盒中，加入封闭液封闭 $30\\mathrm{min}$ ， $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ ；  \n\n3）一抗孵育：吸干封闭液，加入 $1\\%$ BSA 制备的一抗混合液（Runx-2 抗体1：50、ALP 抗体 1：50、OCN 抗体 1：100、OPN 抗体 1：100），置于湿盒内，$4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 孵育过夜；  \n\n4）二抗孵育：吸去一抗，PBS 洗片 3 次，加入 Alexa Fluor $\\textsuperscript{\\textregistered}$ 488 和 Cy3 荧光二抗（ $1\\%\\mathrm{BSA}$ 按 1：600 稀释），置于湿盒内， $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 避光孵育 $45\\mathrm{min}$ ；  \n\n5）细胞核染色及观察：PBS 清洗3 次，避光加入 DAPI（1：600）孵育 $5\\mathrm{min}$ ，PBS 清洗3 次，利用抗淬灭封片剂封片；  \n\n6）荧光显微镜下观察并拍照，并用 Image J 定量分析荧光强度。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 91,
        "chunk": "# 2.4.2.9 油红 O 染色  \n\n将细胞以 $1{\\times}10^{4}/$ 孔的密度种植在 12 孔板中，待细胞贴壁后换液，使用成脂诱导培养基，给与超声介导的雷帕霉素递送处理，具体操作同章节 2.3.2.2 步骤1）。具体步骤如下：  \n\n1）待细胞贴壁后更换成脂诱导培养基 A 液进行培养，3 天后换用成脂诱导培养基B 液进行培养 $24\\mathrm{h}$ ，如此A、B 培养基交替使用培养至第 21 天；2） $10\\%$ 多聚甲醛固定细胞 $10\\mathrm{min}$ ，弃去固定液，PBS 洗涤，加入油红 O 染色液 $400~\\upmu\\mathrm{l}$ 孵育 $30~\\mathrm{min}$ ，移除油红 O 染液，并用 PBS 洗涤 2 次，光镜下观察；3）使用甲醇洗脱染色 $30\\mathrm{min}$ ，并使用酶标仪在 $510\\mathrm{nm}$ 处测量吸光度进行定量。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 92,
        "chunk": "# 2.4.2.10 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 93,
        "chunk": "# 2.4.3 结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 94,
        "chunk": "# 2.4.3.1 细胞增殖与活性  \n\n为了探究超声介导雷帕霉素递送对 OP-BMSCs 的调节作用，我们首先使用CCK-8 法检测不同培养环境中的细胞增殖情况。图 2.10A 所示，在培养第 4 和第 7 天时，OP 组和 OP-UI 组中的 OP-BMSCs 增殖速率显著慢于 Health 组的 H-BMSCs（ $\\mathsf{p}{\\mathrm{<}}0.01$ ），而超声介导雷帕霉素递送可以显著改善 OP-BMSCs 的增殖能力（ $\\cdot\\mathrm{p}{<}0.05)$ ）。随后，Calcein-AM/PI 染色对活死细胞的标记如图2.10B 所示，与Health 组和 OP-UIRa 组相比，OP 和 OP-UI 组中观察到更多红染的死细胞，定量分析显示在健康组、OP 组、OP-UI 组和 OPUIRa 组的细胞存活率分别为$96.04{\\pm}1.74\\%$ 、 $84.89{\\pm}3.76\\%$ 、 $85.99{\\scriptstyle\\pm2.80\\%}$ 和 $92.17{\\scriptstyle\\pm2.84\\%}$ （图 2.10C）。Phalloidin-鬼笔环肽显示与 OP 或 OP-UI 组相比，OP-UIRa 组中的 OP-BMSCs 显示出更好的铺展状态和更多的板足延伸，细胞骨架沿长轴排列并具有更强的荧光强度（图2.10D、E）。  \n\n![](images/89d39461933e21dcbd6dbf665366c2f150bb5d1021c190f3b49764652cdafa6c.jpg)  \n图 2.10（A）CCK-8 法测定细胞增殖情况；（B）Calcein-AM/PI 染色标记活死细胞；（C）细胞存活率计算；(D) Phalloidin-鬼笔环肽染色图像；(E) Phalloidin-鬼笔环肽染色荧光强度定量分析（ $^{*}p<0.05$ ; $**_{p}<0.01\\$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 95,
        "chunk": "# 2.4.3.2 细胞迁移能力  \n\n为研究超声介导雷帕霉素递送对 OP-BMSCs 迁移能力的影响，我们采用了划痕实验与 Transwell 细胞迁移实验进行验证。如图 2.11A 细胞划痕实验所示，制造划痕 $24\\mathrm{h}$ 后，Health 组和OP-UIRa 组的细胞趋向于向划痕中间聚集，而 OP组和 OP-UI 组的细胞表现出迁移较慢，图像中仍有较为明显的划痕。此外，transwell 分析显示，Health 组和 OP-UIRa 组迁移透过孔室底部的细胞数明显高于 OP 组和 OP-UIRa 组（ $\\scriptstyle\\cdot\\mathtt{p}^{<0.05)}$ ）（图 2.11B、C）。  \n\n![](images/bf5393bf4fa4855438cabecfe4ea0b49b53ddb8b873cf7316758dbd891d80611.jpg)  \n图 2.11（A）细胞划痕实验图像；（B）Transwell 细胞迁移实验；(C) 定量分析Transwell 实验细胞迁移数量（ $^{\\cdot}\\ast_{p}<0.05)$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 96,
        "chunk": "# 2.4.3.3 细胞成骨分化  \n\n为研究超声介导雷帕霉素递送对 OP-BMSCs 成骨分化能力的影响，我们对细胞中沉积的钙结节进行了茜素红染色，对成骨分化标志物 ALP、Runx-2、OCN和OPN 进行PCR 检测和免疫荧光分析。  \n\n首先，我们对各实验组进行茜素红染色，直观地评估骨基质的矿化水平，如图 2.12A 所示，在第 7 天时各组钙沉积均较少，但是 Health 组和 OP-UIRa 组还是优于 OP 组和 OP-UI 组，这种差异在第 14 天时更明显。通过氯化十六烷基吡啶洗脱被茜素红着色的钙结节，通过半定量分析显示进一步验证了超声介导雷帕霉素递送可以促进 OP-BMSCs 的矿化（图2.12B）。随后，我们通过 PCR 实验探究各组细胞中成骨相关基因的表达水平。如图 2.12C、D，早期成骨标志物 ALP和Runx-2在Health组和OP-UIRa组中的表达显著高于OP组和OP-UI组（ $\\cdot\\mathbf{p}{<}0.05)$ ）。此外，晚期成骨标志物 OCN 和OPN 的表达情况也具有相似趋势（图 2.12E、F）。相较于 Health 组，OP-UIRa 组只有在第 7 天时的 OCN 和第 14 天时的 OPN 表达水平有所下降（ $(\\mathtt{p}{<}0.05)$ ），其余基因和时间点均无统计学差异，表明超声介导雷帕霉素递送几乎可以使 OP-BMSCs 中成骨基因的表达水平恢复至 H-BMSCs 能力。  \n\n![](images/348cbda262329d262121cc423a563b73ba48603fdb0d2525f2bb830523cc0bd3.jpg)  \n图2.12（A）茜素红染色图像；（B）茜素红染色半定量分析；(C-F) PCR 检测成骨相关基因 ALP、Runx-2、OCN 和 OPN 的表达（ $^{*}p<0.05$ ; $**_{p}<0.01$ ; $\\ast\\ast\\ast_{p}<$ 0.001）。  \n\n为了进一步验证成骨相关标志物在细胞中的表达情况，我们对细胞中的ALP、Runx-2、OCN 和 OPN 蛋白表达情况进行免疫荧光染色（图 2.13A）。如图 2.13B所示，通过对荧光强度的定量分析可知这些成骨相关蛋白在Health 组和OP-UIRa组中的表达显著高于 OP 组和OP-UI 组。  \n\n![](images/d94cafd885b07e57b0894a73d8d2a1a209b84b371b0090dd4afd028a0cf16ba0.jpg)  \n图2.13（A）细胞中成骨相关蛋白 ALP、Runx-2、OCN 和OPN 的免疫荧光染色；（B）定量分析免疫荧光染色图像的荧光强度（ ${}^{:*}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ; $^{***}p<0.001.$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 97,
        "chunk": "# 2.4.3.4 细胞成脂分化  \n\n油红 O 染色被用于观察细胞成脂分化的趋势（图 2.14A）。如图 2.14B 定量分析所示，OP 和 OP-UI 组的脂滴数量增加，显著高于 Health 组和 OP-UIRa 组（ $_{\\cdot\\mathrm{{p}<0.001}}$ ），表明超声介导的雷帕霉素递送较大程度地抑制 OP-BMSCs 成脂分化，虽然不能完全达到与 H-BMSCs 相同的程度。  \n\n![](images/1e543dd90da40b264eb6cefd7bdca47d7a3e33fabf475722a63535605098755d.jpg)  \n图2.14 （A）油红 O 染色图像；（B）油红O 染色定量分析（ $^{*}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ;\\* $^{**}p<0.001\\rangle$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 98,
        "chunk": "# 2.4.4 讨论  \n\n在骨质疏松症和年龄相关的骨丢失中，骨髓中 BMSCs 不仅数量减少，而且其增殖、活性和迁移能力也受到抑制，而成脂分化潜能增加。细胞活力的降低延缓了骨损伤部位干细胞的募集和成骨分化，从而导致骨修复受损 [209]。这些现象被证明与 OP-BMSCs 的低下的自噬水平有关 [210, 211]。在 2.3 章节中我们成功地使用超声介导雷帕霉素递送激活了 OP-BMSCs 的自噬活性，在这里，我们主要观察OP-BMSCs 的自噬被激活后各种细胞功能的恢复情况。  \n\n首先，随着培养时间的延长，各组中的细胞数量显著增加。然而，与 H-BMSCs相比，OP 组和 OP-UI 组中的 OP-BMSCs 的增殖受到抑制（ $\\cdot\\mathtt{p}^{<0.01)}$ ），但这种抑制可以通过雷帕霉素递送来实现部分逆转，该观察结果与先前的研究一致 [212]。活细胞被 Calcein-AM 的绿色荧光标记，PI 则可以特异性透过死细胞的细胞膜，并嵌入 DNA 双螺旋结构使死细胞被红色荧光标记 [213]。Calcein-AM/PI 对细胞进行活死染色也证明通过雷帕霉素递送可以恢复 OP-BMSCs 的存活率。F-肌动蛋白丝在BMSCs 的早期成熟中具有重要作用，通过靶向增殖和分化来调节细胞功能 [214]。本章节中中，细胞 F-肌动蛋白用 phaloidin-鬼笔环肽染色以检测细胞骨架。超声介导的雷帕霉素递送处理的 OP-BMSCs 显示出更好的铺展性和更多的板足延伸。F-肌动蛋白丝和细胞骨架的荧光强度增强有利于 BMSCs 的细胞活性和早期成骨分化 [215]。因此，超声介导的雷帕霉素递送可能具有显著增强 OP-BMSCs 的F-肌动蛋白和细胞骨架重组的作用，从而潜在地改善 OP-BMSCs 的迁移和成骨分化。随后，细胞划痕实验和 transwell 检测证实超声介导的雷帕霉素递送可显著改善OP-BMSCs 的迁移能力。  \n\n除了增殖和迁移外，BMSCs 的成骨分化是骨再生的关键过程。由于过度的骨吸收和有限的骨形成能力，骨质疏松症导致骨量下降并限制损伤后的骨再生。BMSCs 被认为是损伤后参与骨修复的成骨细胞的主要来源。然而，骨质疏松微环境中的BMSCs 数量不足，部分丧失了自我更新和分化能力。先前的研究显示骨质疏松症中的骨丢失不仅是由于成骨活性降低和破骨细胞活化增加的失衡，而且与骨髓腔中的高脂肪有关 [216]。由于雌激素缺乏的环境，OP-BMSCs 具有潜在分化为脂肪细胞而不是成骨细胞的趋势，会导致骨丢失和脂肪积聚 [217, 218]。因此，调节OP-BMSCs 成骨-成脂分化的平衡是促进骨质疏松症患者假体界面骨再生和骨整合的潜在策略。在本章节，我们通过茜素红染色、RT-qPCR、免疫荧光和油红O 染色等一列研究证明超声介导的雷帕霉素递送可以调节OP-BMSCs 成骨-成脂分化平衡，即诱导 OP-BMSCs 成骨分化而抑制成脂分化。  \n\n绝经后骨质疏松症中 BMSCs 的退行性改变与骨破坏有关，这些退行性变化包括细胞增殖能力受损、分化不平衡和衰老加剧 [219, 220]。我们的结果表明，与 H-BMSCs 相比，OP-BMSCs 的增殖、存活、迁移和成骨分化能力降低，而成脂肪分化能力提高，这些结果与之前的研究结果一致 [45, 196]。将OP 组和OP-UI 组相比可见，单独对 OP-BMSCs 进行超声处理（不负载雷帕霉素）并不影响细胞功能，而超声介导的雷帕霉素递送有效地改善了 OP-BMSCs 的细胞增殖、活力、迁移和成骨-成脂分化平衡。因此，我们推测超声介导的雷帕霉素递送可以有效逆转 OP-BMSCs 的退行性状态，这为骨质疏松症患者假体植入后增强界面骨整合的提供了替代策略。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 99,
        "chunk": "# 2.4.5 小结  \n\n相较于 H-BMSCs，OP-BMSCs 的增殖、存活、迁移和成骨分化能力降低，而成脂肪分化能力提高。OP-BMSCs 这些受损的细胞功能可以通过雷帕霉素递送来激活 OP-BMSCs 的自噬活性而完全或者部分恢复，从而为增强骨质疏松症患60  \n\n者假体植入后界面骨整合提供了替代策略。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 100,
        "chunk": "# 2.5 超声介导雷帕霉素递送促进骨质疏松状态下假体界面骨整合",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 101,
        "chunk": "# 2.5.1 实验仪器与材料  \n\n2.5.1.1 实验仪器   \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>超声电导仪</td><td>北京诺亚同舟医疗技术有限公司</td></tr><tr><td>外科手术器械</td><td>杭州青牛医疗器械有限公司</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>比利时 Bruker 公司</td></tr><tr><td>硬组织切片机</td><td>德国Leica公司</td></tr><tr><td>冰冻切片机</td><td>德国Leica公司</td></tr><tr><td>万能力学测试机</td><td>日本Shimadzu公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他仪器同 2.2.1.1。  \n\n2.5.1.2 主要试剂  \n\n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>美国Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>碘伏毒液</td><td>山东利尔康医疗科技有限公司</td></tr><tr><td>兽用青霉素</td><td>华北制药集团有限责任公司</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>苏木精和伊红（H&E）染料</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>Van Gieson 染料</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>小鼠抗Runx-2抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>兔抗 ALP抗体</td><td>美国Abcamy公司</td></tr><tr><td>小鼠抗OCN抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>兔抗OPN抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>山羊抗兔Cy3荧光二抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠AlexaFluor?488 荧光二抗</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>北京索莱宝生物科技有限公司</td></tr><tr><td>含DAPI抗淬灭封片剂</td><td>美国Vector公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他试剂同 2.3.1.2 及 2.4.1.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 102,
        "chunk": "# 2.5.1.3 实验动物  \n\n新西兰大耳白兔：由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 103,
        "chunk": "# 2.5.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 104,
        "chunk": "# 2.5.2.1 骨质疏松兔股骨远端假体植入和组织获取  \n\n通过双侧卵巢切除术法制备骨质疏松兔模型，详细造模过程见章节 2.2.2.1。卵巢切除术后 10 个月骨质疏松模型建立，植入 3D 打印微孔假体至兔左侧股骨远端外侧髁。假体植入手术具体操作步骤为：术前 12h 禁食水， $3\\%$ 戊巴比妥钠（ $\\mathrm{\\50mg/kg}^{\\mathrm{'}}$ ）耳缘静脉注射，麻醉后，右侧卧位，暴露左侧膝关节。术区常规备皮、消毒、铺单。沿髌骨沟外侧入路切开皮肤，逐层分离软组织，暴露股骨远端外侧髁。使用定制的手钻于股骨外上髁处制备深度为 $10\\mathrm{mm}$ ，直径为 $5\\mathrm{mm}$ 的圆柱形骨缺损，然后植入与之匹配的 3D 打印微孔支架，随后逐层缝合软组织、闭合皮肤。术后兔子在笼内自由运动，连续 3 天肌肉注射青霉素（ $1.5\\mathrm{mg/kg}\\cdot$ ）以防止感染，伤口碘伏消毒至愈合。  \n\n动物实验共分为 4 个组，每组12 只。10 个月前未进行卵巢切除的假手术组中的非骨质疏松兔子作为健康对照组（Health 组），并在假体植入后不接收额外治疗处理。骨质疏松兔子假体界面植入后，左侧股骨远端外侧髁分别接受无额外治疗、不含雷帕霉素的单独超声治疗和超声介导的雷帕霉素递送，分别简称为 OP组、OP-UI 组和 OP-UIRa 组。OP-UIRa 组即为将 $200\\upmu\\mathrm{l}$ 雷帕霉素溶液（ $\\mathrm{{(1000nM)}}$ ）加入明胶海绵中，然后将明胶海绵紧密贴合在超声发射器和左股骨远端外侧髁的皮肤之间，用于药物递送。OP-UI 组的明胶海绵中为生理盐水浸湿，不含雷帕霉素。在假体植入后 1 周开始超声治疗，每周 2 次。设置超声电导仪的频率为 30$\\mathrm{kHz}$ ，强度为 $45\\mathrm{W/cm}^{2}$ ，时间为 $10\\mathrm{min}$ 。  \n\n所有动物在处死前第 14 天和第4 天肌肉注射钙黄绿素（ $({8\\mathrm{mg/kg}})$ ），以检测骨形成过程中的矿物质沉积率（Mineral apposition rate，MAR），矿化表面/骨表面（Mineralizing surface per bone surface, MS/BS ）和 骨形 成率 / 骨表 面（ Boneformation rate per bone surface, BFR/BS）。术后第 12 周，过量麻醉法处死实验动物，收集左侧股骨样本，并将其固定在 $4\\%$ 多聚甲醛中或储存在- $.80^{\\circ}\\mathrm{C}$ 下进行进一步研究。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 105,
        "chunk": "# 2.5.2.2 H&E 染色  \n\n收集左侧股骨远端皮肤和内脏，进行 H&E 染色以评估超声介导雷帕霉素递送的安全性。具体步骤如下：  \n\n1）取材：使用 $4\\%$ 多聚甲醛将收集的新鲜组织固定 $48\\mathrm{h}$ ，随后使用手术刀在通风橱内将组织修理平整，将修切好的组织进行标记并置于脱水盒内；  \n\n2）脱水：将脱水盒置于吊篮中，在脱水机内依次使用不同浓度的酒精进行梯度脱水，即 $75\\%$ 酒精脱水 $4h{-}85\\%$ 酒精脱水 $2h{-}90\\%$ 酒精脱水 $2h{-}95\\%$ 酒精脱水 $\\mathsf{1h}.$ -无水乙醇I 脱水 $30\\mathrm{min}.$ -无水乙醇II 脱水 $30\\mathrm{min}.$ -醇苯 $5{\\mathrm{-}}10\\operatorname*{min}.$ -二甲苯 I 5-10 min-二甲苯 $\\mathrm{II}5{-}10\\mathrm{min}.$ -蜡 $\\mathrm{~I~}1\\mathrm{~h~}$ -蜡 $\\mathrm{~II~}1\\mathrm{~h}.$ -蜡 III $^{\\textrm{1h}}$ ；  \n\n3）包埋：将浸好蜡的组织块置于包埋机中进行包埋，先将充分融化的蜡放入包埋框中，在蜡凝固前将组织从脱水盒中取出，并按照包埋面的要求放入包埋框中并进行标记，随后在- $-20^{\\circ}$ 的冻台中进行冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块至理想界面；  \n\n4）切片：将修整好的蜡块固定在石蜡切片机上进行组织切片，片厚约 ${5\\upmu\\mathrm{m}}$ ，将切片漂浮于摊片机 $40^{\\circ}\\mathrm{C}$ 温水中使组织片展平，随后用载玻片轻柔的将组织捞起，置于 $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ 烘箱内烤片，至烤干水烤化蜡后取出切片，常温保存备用；  \n\n5）石蜡切片脱蜡至水：将切片依次放入二甲苯Ⅰ $20\\mathrm{min}.$ 二甲苯Ⅱ $20\\mathrm{min\\mathrm{.}}$ 无水乙醇Ⅰ $10\\mathrm{min}.$ -无水乙醇Ⅱ $10\\mathrm{min}{\\cdot}95\\%$ 酒精 $5\\mathrm{min}{\\cdot}90\\%$ 酒精 $5\\mathrm{min}{-}80\\%$ 酒精$5\\mathrm{min}{-}70\\%$ 酒精 $5\\mathrm{min}$ -蒸馏水洗；  \n\n6）苏木素染细胞核：使用Harris 苏木素将切片染 $3{-}8\\operatorname*{min}$ ，自来水冲洗， $1\\%$ 盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗， $0.6\\%$ 氨水返蓝，用流水进行冲洗；  \n\n7）伊红染细胞质：使用伊红染液将切片染色 $1{-}3~\\mathrm{min}$ ；  \n\n8）脱水封片：依次将切片放入 $95\\%$ 酒精 $15\\mathrm{min}{\\cdot}95\\%$ 酒精 II 5 min-无水乙醇  \n\nⅠ 5 min -无水乙醇Ⅱ 5 min -二甲苯Ⅰ 5 min -二甲苯Ⅱ 5 min 中脱水透明，将切片从二甲苯中拿出来稍晾干，用中性树胶进行封片；  \n\n9）使用显微镜观察，并进行图像采集分析。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 106,
        "chunk": "# 2.5.2.3 Micro-CT 评估骨长入  \n\n使用Micro-CT 对收集的股骨远端组织进行扫描，工作参数设置为电压： $90\\mathrm{V}$ ，电流： $114~\\upmu\\mathrm{A}$ ，扫描分辨率： $18~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ，并选用 $\\mathrm{\\Al/Cu}$ 滤片以避免金属伪影。具体观察指标如下：  \n\n1）获取 X 线正位片以观察假体有无松动、移位的情况；  \n2）假体界面骨长入情况分析：使用 NRecon 软件选取支架所在区域为感兴趣区域进行三维重建，并定量分析骨体积百分比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb. Th）、骨小梁数目（Tb. N）和骨小梁分离度（Tb. Sp）；  \n3）假体周围骨质情况分析：选取股骨远端 2 cm 区域（包含假体）为感兴趣区域，分析界面周围骨形态学参数，包括骨体积百分比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb. Th）、骨小梁数目（Tb. N）和骨小梁分离度（Tb. Sp）；另外选取假体近端及近处1 cm 区域为感兴趣区域分析皮质骨厚度（Ct.Th）和皮质骨面积（Ct.Ar）。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 107,
        "chunk": "# 2.5.2.4 硬组织切片评估骨整合效果  \n\n收集股骨远端样本，制备未脱钙硬组织切片，Van-Gieson 染色观察再生骨组织与假体微孔界面整合情况，具体步骤如下：  \n\n（1）股骨远端样本放入 $10\\%$ 甲醛溶液中浸泡 $48\\mathrm{h}$ ， $70\\%$ 酒精处理 $2\\mathrm{h}$ ， $95\\%$ 酒精处理 $20\\mathrm{h}$ ， $100\\%$ 酒精处理 $2\\mathrm{h}$ ，随后在减压下干燥 $6\\mathrm{{h}}$ ;（2）通过上述操作凝固蛋白、防腐、脱水、干燥等处理后，将组织置于装有聚甲基丙烯酸甲酯单体的玻璃管中，在低真空下浸渗 $30~\\mathrm{min}$ 至无气泡冒出，随后在 $27^{\\circ}\\mathrm{C}$ 水浴中固化。为避免聚甲基丙烯酸甲酯单体在固化时发生炸裂，应特别注意固化时保持温度均匀;（3）使用硬组织切片机制备约 $200\\upmu\\mathrm{m}$ 的组织切片，用速干胶将切片粘于树脂片上，用磨片机将树脂片上的组织切片磨至约 $50~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 厚，抛光；（4）将切片依次放入浓度为 $10\\%$ 、 $80\\%$ 、 $95\\%$ 的酒精内脱水各 $1\\mathrm{min}$ ，取出后用蒸馏水洗涤；  \n\n（5）有机溶剂脱去有机树脂，Weigert 氏苏木素染液染 $20\\mathrm{min}$ ，并流水冲洗$10\\mathrm{min}$ ，使用 Van-Gieson 染液染色 $5\\mathrm{min}$ ；  \n\n（6）依次用浓度 $80\\%$ 、 $90\\%$ 的酒精脱水后，用自来水冲洗 $30\\mathrm{min}$ ；  \n\n（7）放入二甲苯中两次，其浓度为 $10\\%$ ，透明后置于载玻片上用加拿大胶封固。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 108,
        "chunk": "# 2.5.2.5 力学测试评估界面骨整合与周围骨质情况  \n\n1）支架推出实验评估假体-骨界面的整合强度。具体步骤如下：股骨远端内侧进行打磨，从内侧髁暴露支架内部圆面，用牙托粉将股骨内侧髁固定于操作台上，使支架纵轴与台面方向垂直；万能力学试验机上端固定直径为 $6\\mathrm{mm}$ 的硬质挤压点，并与固定支架上端纵向对齐；以 $0.1~\\mathrm{mm/s}$ 速度对股骨远端外侧髁的支架圆面进行挤压推出，每 0.5s 记录挤压点处受力情况，直至支架完全脱出，记录全称挤压点受力最大值。  \n\n2）三点弯曲实验评估周围骨质强度。具体步骤如下：将股骨远端样本放在跨距为 $30~\\mathrm{mm}$ 的马鞍形支具上，其中金属假体植入部位位于正中间位置；使用万能力学试验机对马鞍形支具的中间位置骨干处施加压力，压力加载速度为 2$\\mathrm{{mm/min}}$ ，试验以股骨样本断裂为结束点。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 109,
        "chunk": "# 2.5.2.6 界面周围骨质中 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的蛋白水平检测  \n\n在力学测试推出支架后，收集假体界面周围骨质，通过 Western Blot 检测骨质中 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的蛋白表达水平，以评估假体界面周围的自噬情况。具体步骤如下：  \n\n1）骨组织总蛋白提取：将收集的骨组织置于研钵中加入 1 ml PBS，在液氮上研磨匀浆至肉眼无可见固体组织，收集液体，离心（ $2000~\\mathrm{rpm}$ ，5min），去上清。称取 $100\\mathrm{mg}$ 粉碎的骨组织，放置到离心管柱中，加入 $80\\mathrm{mg}$ 蛋白研磨粉覆盖组织样品，加入 ${100}\\mathrm{ul}$ 含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液。立刻用塑料研磨棒按住组织扭转研磨 $3\\mathrm{min}$ ，将剩余的 ${100}\\mathrm{ul}$ 裂解液加入，继续研磨 $1\\mathrm{min}$ 。离心（12000rpm，1min），取上清即为总蛋白，并将其转移到一个新管。管底的白色沉淀是穿过柱子的蛋白研磨粉，弃掉即可。取 $160\\upmu\\mathrm{l}$ 上清液中加入 $40\\upmu\\updownarrow5\\times$ 蛋白上样缓冲液， $100^{\\circ}\\mathrm{C}$ 水浴加热 $5\\mathrm{min}$ ，置于冰上冷却，保存于- $-20^{\\circ}\\mathrm{C}$ 备用 ；  \n\n2）随后BCA法测定总蛋白浓度和Western Blot检测的操作步骤同章节2.3.2.2中的3）和 4）。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 110,
        "chunk": "# 2.5.2.7 界面周围骨质中成骨相关基因检测  \n\n在力学测试推出支架后，收集假体界面周围骨质，通过 RT-qPCR 法检测骨质中成骨相关基因 ALP、Runx-2、OCN 和 OPN 的表达水平。具体步骤如下：  \n\n1）骨组织总RNA 提取：将收集的骨组织至于研钵中加入 $1\\mathrm{ml}\\mathrm{PBS}$ ，在液氮上研磨匀浆至肉眼无可见固体组织，收集液体，离心（ $2000~\\mathrm{rpm}$ ，5min），去上清。根据Promega 总RNA 提取试剂盒的说明书，具体步骤同章节2.4.2.7。  \n\n2）其与步骤同章节 2.4.2.7。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 111,
        "chunk": "# 2.5.2.8 界面周围骨质中成骨相关蛋白免疫荧光染色  \n\n在力学测试推出支架后，收集股骨远端样本，通过疫荧光染色检测骨质中成骨相关蛋白ALP、Runx-2、OCN 和OPN 的表达水平。具体步骤如下：  \n\n1）股骨远端样本放入 $10\\%$ 多聚甲醛溶液中浸泡 $48\\mathrm{h}$ ，PBS 清洗 3 次，每次$20\\mathrm{min}$ ，用蒸馏水洗清洗 3 次，每次 $20\\mathrm{min}$ ；  \n\n2）骨组织样本组织转移至 20-30 倍体积的 $10\\%$ EDTA 脱钙液中，每周换液1 次直至终点，脱钙总时间约为 2 个月，待脱钙完成后，用蒸馏水冲洗数次；  \n\n3）常规脱水、包埋、切片和石蜡切片脱蜡至水同章节 2.5.2.2 中步骤 2）、3）、4）和5）；  \n\n4）抗原修复：将组织切片放入装满 EDTA 抗原修复缓冲液（ $\\mathfrak{p H}9.0\\dot{!}$ ）的修复盒中，置于微波炉内行抗原修复。中火至沸后断电间隔 $10~\\mathrm{min}$ 中低火至沸，操作过程中避免缓冲液过度蒸发造成干片。自然冷却后将组织切片放入 PBS（pH7.4）中，在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 $5\\mathrm{min}$ ；  \n\n5）穿孔及封闭：取切片室温晾干，PBS 洗片3 次， $0.5\\%$ Triton X-100 室温通透 $15\\mathrm{min}$ ，PBS 洗片3 次，加入封闭液于 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 封闭 $30\\mathrm{min}$ ；  \n\n6）加一抗：吸干封闭液，加入 $1\\%\\mathrm{BSA}$ 稀释的一抗（小鼠抗 Runx-2 抗体1：50 稀释和兔抗 ALP 抗体 1:100 稀释，小鼠抗 OCN 抗体 1：50 稀释和兔抗 OPN抗体1：100 稀释），置于湿盒内， $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 下孵育过夜，操作过程中在湿盒内加入少量水，避免抗体蒸发；  \n\n7）加二抗：切片置于 PBS 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 $5~\\mathrm{min}$ ，将切片稍甩干，随后在圈内滴加山羊抗兔 Cy3 荧光二抗或山羊抗小鼠Alexa Fluor $\\textsuperscript{\\textregistered}$ 488 荧光二抗（利用 $1\\%\\mathrm{BSA}$ 按1：600 稀释），置于湿盒内， $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 避光孵育 $1\\mathrm{h}$ ；  \n\n8）DAPI 染色复染细胞核：玻片置于PBS（ $\\mathsf{p H}7.4\\AA\\AA\\AA$ ）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 $5~\\mathrm{min}$ ，将切片稍甩干，随后在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 $10\\mathrm{min}$ ；  \n\n9）封片：将切片放入 PBS（ $\\mathrm{pH}7.4\\AA\\AA$ ）中，在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次$5\\mathrm{min}$ ，将切片稍甩干，随后用抗荧光淬灭封片剂进行封片；  \n\n10）镜下观察拍照：切片置于荧光显微镜下观察，并拍摄图像、分析。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 112,
        "chunk": "# 2.5.2.9 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 113,
        "chunk": "# 2.5.3 结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 114,
        "chunk": "# 2.5.3.1 超声介导雷帕霉素递送体内安全性分析  \n\n为了探究超声介导雷帕霉素递送对局部皮肤以及内脏的安全性，我们收集探头接触的左膝外侧髁皮肤及主要脏器进行 H&E 染色。与植入支架后不接受额外治疗的 OP 组相比，每周 2 次接受超声介导的雷帕霉素递送的 OP-UIRa 组中的皮肤组织形态未见明显改变（图 2.15A），表明体内研究使用的超声电导仪参数（即频率： $30\\mathrm{kHz}$ ，强度： $45\\mathrm{W}/\\mathrm{cm}^{2}$ ，时间： $10\\mathrm{min}$ ）对接触皮肤无损害，可以作为常规导药功率使用。随后，为了探究递送进入体内的雷帕霉素是否对脏器产生影响，我们收集了主要脏器，包括心、肝、脾、肺和肾进行 H&E 染色。如图2.15B 显示，结果显示OP-UIRa 组主要脏器的组织形态学结构与 OP 组相比无显著差异，均保持正常的形态。  \n\n![](images/47046900d9b8c368156727e09524e25204e4c067899cf277f4ddf6aedcc9b36a.jpg)  \n图 2.15（A）左膝外侧髁皮肤 H&E 染色；（B）主要脏器，包括心、肝、脾、肺  \n\n和肾H&E 染色。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 115,
        "chunk": "# 2.5.3.2 影像学评估假体界面骨整合效果  \n\n左侧股骨远端正位 X 线片显示，3D 打印钛合金微孔假体与股骨长轴垂直，未发生明显松动、移位（图 2.16A）。随后，通过 Micro-CT 检测假体界面的表面和微孔内部的骨形成。如图 2.16B 典型的3D 重建图像显示与OP 和 OP-UI 组相比，OP-UIRa 组中具有更多的骨组织（黄色）在假体表面和孔隙中，甚至达到了与 Health 组相似的骨量。进一步的定量分析表明，Health、OP、OP-UI 和 OP-UIRa 组的 BV/TV 值分别为 $20.5{\\pm}2.7\\%$ ， $12.4{\\pm}2.5\\%$ ， $13.2{\\pm}2.0\\%$ 和 $17.6{\\pm}2.4\\%$ 。与OP 组和 OP-UI 组相比，OP-UIRa 组在植入后 12 周时表现出明显增加的骨体积分数（BV/TV， $\\mathsf{p}{<}0.05)$ ）、骨小梁厚度（Tb.Th， $\\mathsf{p}{<}0.05$ ）和骨小梁数量（Tb.N，$\\mathsf{p}{<}0.01$ ），并减少了界面新骨的骨小梁分离度（Tb.Sp， $\\mathsf{p}{<}0.05$ ）（图 2.16 C-F）。此外，这些结果显示 OP-UIRa 组和 Health 组之间的骨形态计量学参数并无显著差异，表明通过经皮超声介导的雷帕霉素递送可以有效促进骨质疏松状态下的微孔假体表面的骨形成与长入，甚至可达到健康状态下的再生骨量水平。  \n\n![](images/24607f7a1f45f5c934489fa58adadefd06a2ba2ac70a9cb235761a564ea3ed61.jpg)  \n图 2.16（A）左股骨远端 X 线正位片；（B）Micro-CT 3D 重建图像白色为支架，黄色为骨组织；（C-F）Micro-CT 结果定量分析 BV/TV，Tb.Th，Tb.N 和 Tb.Sp 参数（ $^{*}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 116,
        "chunk": "# 2.5.3.3 组织学评估假体界面骨形成与整合效果  \n\n为了观察周围骨组织与假体界面的骨形成与整合效率，我们制备了不脱钙的硬组织切片，并在荧光显微镜下直接观察钙黄绿素双标染色（图2.17A）。动态组织形态计量分析结果表明，与 OP 和OP-UI 组相比，OP-UIRa 组加速了骨缺损区域的新骨形成，如 MAR，MS/BS，BFR/BS 显著增加；但是，相较于Health 组，OP-UIRa 组 MAR 和 BFR/BS 值仍具有差异（ $\\scriptstyle\\cdot\\mathtt{p}<0.05\\ \\lambda$ ）（图 2.17B-D）。随后将硬组织切片进行 Van Gieson 染色观察骨整合情况。如图 2.17E 所示，OP 组和 OP-UI 组的再生骨量有限，再生骨和假体界面之间存在明显的间隙；而在 OP-UIRa和Health 组中，可见再生骨组织与假体表面微孔结构形成明显的结合，并长入内部孔隙中；而相较于 OP-UIRa 组，Health 组中再生的骨组织更能长入到深达微孔支架的中心位置。这些结果表明，经皮超声介导的雷帕霉素递送可以显著促进3D 打印微孔界面在骨质疏松状态下的骨形成和骨整合，从而减少假体植入后松动和移位等术后并发症的发生。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 117,
        "chunk": "# 2.5.3.4 力学评估假体界面骨整合效果  \n\n为了进一步验证假体界面和宿主骨之间的骨整合强度，我们进行了生物力学测试来记录支架推出时的峰值力。Health 组、OP 组、OP-UI 组和 OP-UIRa 组的支架推出力峰值分别为 $558.5{\\pm}52.2\\mathrm{N}$ ， $227.5{\\pm}31.4\\mathrm{N}$ ， $277.0{\\scriptstyle\\pm53.0\\mathrm{N}}$ 和 $490.2{\\pm}31.4\\$ N（图2.17F）。力学测试结果与影像学和组织学评估结果基本一致，即新骨生成量和骨小梁长入深度与假体界面骨整合强度成正比。  \n\n![](images/a41b02f5b30a92f1fd1059ce9863586851e9bfab993292f915f1b8c817ff6a41.jpg)  \n图2.17（A）不脱钙的硬组织切片观察钙黄绿素荧光双标；（B-D）通过钙黄绿素荧光双标对 MAR、MS/BS 和 BFR/BS 进行定量统计；（E）Van Gieson 染色观察假体界面骨长入与整合（黑色区域表示微孔假体，红色区域表示骨组织）；（F）植入12 周后通过生物力学支架推出测试评估骨整合强度（ $^{*}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ;  \n\n\\*\\* $^{*}p<0.001)$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 118,
        "chunk": "# 2.5.3.5 假体界面周围骨量与骨质情况分析  \n\n通过 Micro-CT 和生物力学测试检测假体界面周围的骨量与骨质情况，以评估关节置换术后假体周围骨折的发生率。股骨远端代表性横断面图表明，与 OP和 OP-UI 组相比，Health 组和 OP-UIRa 组的假体远端具有更致密的小梁骨结构和假体近端具有更厚的皮质骨厚度（图 2.18A）。如图 2.18B 所示，选取股骨远端$2\\mathrm{cm}$ 区域（包含假体）为感兴趣区域，分析界面周围骨形态学参数表明，Health、OP、OP-UI 和 OP-UIRa 组的 BV/TV 值分别为 $36.81{\\scriptstyle\\pm4.92\\%}$ 、 $22.73{\\scriptstyle\\pm3.69\\%}$ 、$21.85{\\scriptstyle\\pm2.02\\%}$ 和 $28.83{\\scriptstyle\\pm4.42\\%}$ 。此外，骨小梁分析结果与 BV/TV 一致，即相比于OP 和 OP-UI 组，Health 组和 OP-UIRa 组中，假体界面周围松质骨的 Tb.Th 和Tb.N 显著增加，Tb.Sp 显著降低。另外选取假体近端水平及近处 1 cm 区域为感兴趣区域分析皮质骨厚度（Ct.Th）和皮质骨面积（Ct.Ar）。如图2.18C 所示，OP-UIRa 组的 Ct.Th 和 Ct.Ar 参数明显优于 OP 和 OP-UI 组（ $\\scriptstyle(\\mathtt{p}<0.05)$ ），与 Health 组并无显著差异。  \n\n随后，三点弯曲实验被用于进一步验证假体周围骨质的抗折强度（图2.18D）。在OP-UIRa 的远端股骨中观察到明显更大的最大失效载荷，其约为 OP 组和OP-UI 组的1.29 倍和1.28 倍。这些结果提供了坚实的证据证明超声介导的雷帕霉素递送可显著改善假体界面周围骨量和骨质，并有望减少在骨质疏松模型中假体植入后假体周围骨折的发生率。  \n\n![](images/7d6a594f72a5a24233c6ca0388079d2b23c7a8091db13a76a3677a556a68c894.jpg)  \n图2.18（A）Micro-CT 观察假体界面远端和近端的骨量和骨质情况；（B）股骨远端 $2\\ \\mathrm{cm}$ 区域（包含假体）的骨形态学参数分析，包括 BV/TV、Tb.Th、Tb.N 和Tb.Sp；（C）假体近端水平及近处1 cm 区域皮质骨参数分析，包括Ct.Th 和Ct.Ar；（D）生物力学三点弯曲实验分析该节段骨的抗折强度（ $^{*}p<0.05$ ; $**_{p}<0.01\\dot{,}$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 119,
        "chunk": "# 2.5.3.6 超声介导雷帕霉素递送激活假体界面周围自噬  \n\n为了研究超声介导的雷帕霉素递送增强骨质疏松状态下骨整合的体内机制，我们收集了假体界面表面和孔隙中的骨组织，通过 Western Blot 检测自噬通路关键蛋白以评估局部骨组织中的自噬水平（图 2.19A）。结果表明，超声介导的雷帕霉素递送显著抑制假体周围 mTOR 表达，激活 LC3 II/I，并清除累积的 P62 蛋白，从而上调骨质疏松状态下假体界面周围的自噬活性（图 2.19B）。  \n\n![](images/0cfd3eac70101e6afd4c3a2739b7ea5cbcc4af74cd048d31b121d3eac50087b0.jpg)  \n图 2.19（A）Western Blot 显影条带及相应分子量， $\\upbeta$ -actin 为内参分子；（B）各组蛋白条带灰度值统计结果（ $^{*}p<0.05$ ; $**_{p}<0.01\\dot{.}$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 120,
        "chunk": "# 2.5.3.7 超声介导雷帕霉素递送促进假体界面周围成骨标志物表达  \n\n将假体界面表面、孔隙中以及假体周围的骨组织进行检测以分析局部微环境中的成骨情况。如图 2.20A 所示，RT-qPCR 分析显示与 OP 组和 OP-UI 组相比，OP-UIRa 组成骨相关基因 Runx-2、ALP、OCN 和 OPN 的表达水平显著提高；此外，OP-UIRa 组的 Runx-2 和 OCN 水平低于 Health 组（ $(\\mathfrak{p}{<}0.05)$ ），但 ALP 和 OPN表达与 Health 组相似。  \n\n随后，在假体界面被推出后，对骨组织脱钙并进行免疫荧光染色以评估周围骨组织中成骨相关蛋白的表达（图 2.20B）。定量分析荧光强度显示，相较于 OP组和 OP-UI 组，超声介导雷帕霉素递送显著增加了 Runx-2、ALP、OCN 和 OPN在假体界面周围的表达；此外，OP-UIRa 组的 ALP 和 Runx-2 表达低于 Health 组（ $\\cdot\\mathrm{p}{<}0.05)$ ），但 OPN 和 OCN 水平与 Health 组相似（图 2.20C）。这些结果显示超声介导雷帕霉素递送能够显著促进骨质疏松状态下植入的假体界面及周围骨组织中成骨标志物的表达。  \n\n![](images/43c6b598c183cd3d1dcd7898a75ed36537c276a78775f631caea9b9682f149cb.jpg)  \n图 2.20（A）RT-qPCR 分析成骨相关基因 Runx-2、ALP、OCN 和 OPN 在假体界面周围骨组织中的表达情况；（B）假体界面周围骨组织的 Runx-2、ALP、OCN和OPN 免疫荧光染色；（C）定量分析成骨相关蛋白的荧光强度（ $^{\\cdot}\\ast_{p}<0.05$ ; $\\ast\\ast_{p}$ $\\mathrm{~<0.01~}\\AA$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 121,
        "chunk": "# 2.5.4 讨论  \n\n随着人口老龄化的加剧，越来越多的接受关节置换术患者伴随患有骨质疏松症。一项回顾性研究发现，接受了髋关节置换手术人群中， $50\\%$ 的患者患有骨质疏松症，其中女性 $53.4\\%$ 和男性 $7\\%$ [35]。由于骨质疏松微环境中过度的骨丢失和低下的成骨能力，使得骨再生能力受限以及假体界面的骨整合不足，从而增加了术后并发症发生，如假体移位和松动以及假体周围骨折等 [221, 222]。因此，提高骨质疏松患者假体界面的骨整合效率具有极大的临床意义。考虑到骨质疏松状态下低下的骨再生与骨整合能力部分归因于 OP-BMSCs 低下的自噬水平所致，使用经典的自噬激活剂——雷帕霉素来促进假体界面骨整合是一个值得考虑的策略。但是，雷帕霉素的全身副作用，如免疫抑制，可能会限制其全身应用来促进骨质疏松症中假体骨整合 [223, 224]。因此，寻找一种有效的局部给药方法，调节 OP-BMSCs 的自噬水平以获得优化的骨整合效果，是一种潜在的替代方法。  \n\n本研究拟通过局部递送自噬激活剂——雷帕霉素以激活 OP-BMSCs 低下的自噬水平，从而促进 3D 打印假体界面的骨整合。与口服和注射的传统给药方法相比，治疗性超声递送药物的转运效率可极大地提高，因此，局部超声递送药物可以减少药物使用剂量，从而避免对全身器官的毒性和损伤，此外优势还包括消除首过代谢，以剂量控制的方式实现个体化给药，无创模式避免了避免穿刺给药潜在的感染风险和引起的疼痛 [225]。此外，这种局部药物递送方式还可以在治疗过程中根据复查结果随时调整药物使用剂量，达到个体化的标准。在超声递送药物的应用中，超声的频率范围参数可以在 0.02 和16MHz 之间的变化；强度参数可以在 0.008 和 $50\\mathrm{W}/\\mathrm{cm}^{2}$ 之间变化。其中，超声波强度是一个主要限制因素，过大的强度可能会造成潜在的皮肤损伤。为了研究透皮超声对局部皮肤的影响以及雷帕霉素对器官的毒性，对皮肤以及主要内脏（心、肝、脾、肺和肾）进行了 H&E染色。结果证明在本研究中我们使用的超声电导仪参数（即频率： $30\\mathrm{kHz}$ ，强度：$45\\mathrm{W/cm}^{2}$ ，时间： $10\\mathrm{min}$ ）不会对局部皮肤产生损伤；而每次 $200\\upmu\\mathrm{l}$ 雷帕霉素溶液（ $1000\\mathrm{nM}\\rangle$ ）、一周 2 次的递药频次也不会对对器官造成毒性和损伤。这些结果表明，本研究中使用的超声介导的雷帕霉素递送策略具有良好的生物安全性，为体内应用促进假体界面骨整合提供了理论基础。  \n\n我们在骨质疏松动物模型体内验证超声介导的雷帕霉素递送策略的骨整合效果。首先，在股骨外侧髁缺损模型中，我们使用特定的钻头制备略小于圆柱形假体尺寸的骨缺损（缺损深度： $10\\mathrm{mm}$ ，直径： $5\\mathrm{mm}$ ；假体长度： $10\\mathrm{mm}$ ，直径：$6\\mathrm{mm}.$ ），以模拟临床的压配式假体植入，以增加了植入初期假体的稳定性，避免假体微动和利于界面骨整合的发生。除了假体界面初始稳定性不足，另一种造成假体松动的常见原因是假体磨损后脱落的金属或高分子颗粒引起的炎症反应。散落在假体周围的颗粒被机体免疫系统识别并视为为异物，趋化巨噬细胞吞噬颗粒，随后启动一系列炎症及联反应，引起假体周围软组织坏死和骨溶解，阻碍骨整合的发生 [226, 227]。在 2.1.3 章节中，我们发现制备的 3D 打印钛合金微孔假体表面有大量未熔融的Ti6Al4V 粉末，这些颗粒可能发生脱落引起无菌性炎症，从而影响骨整合的潜在风险。在此，我们通过股骨远端 X 线正位片未见骨溶解征象，且假体均在位，无明显松动，基本可排除假体表面钛合金颗粒脱落引起的不良后果。随着工程技术的发展，3D 打印作为一种高精度、个体化定制式的骨科假体制造方法而被广泛应用 [228]。3D 打印技术，又被称为增材制造或者快速成型技术，通过在电脑上设计三维实体模型文件，然后逐层堆积的方式来制备具有复杂结构的个性化植入物 [229]。相比于传统的植入物制备手段，3D 打印技术能够快速制造出孔隙形状、孔隙率、孔径大小和宏观形状等参数精确可控的个体化假体 [230,231]。我们制备的孔径、孔隙率及机械性能与宿主骨相似的仿生微孔钛合金支架，具有足够的强度来提供力学支撑，并且与传统钛合金假体相比，有效的减少假体的弹性模量以避免与骨之间的应力屏蔽作用；并且互通的孔隙结构增加了假体表面积，增强了界面与周围组织的结合力与初始稳定性，同时也能够诱导周围骨组织长入微孔内部。在 X 线正位片结果中显示各组假体均在位，无明显松动、移位，以及 Micro-CT 和组织学切片表明各组微孔界面或多或少均有骨组织长入，显示3D 打印微孔假体界面确能提供适当的初始稳定性和诱导骨长入。但是，在骨质疏松状态下，不给与特殊处理的 OP 组和 OP-UI 组骨长入以及力学结合强度明显不足，是否能提供长期可靠的稳定性仍有待商榷。经过章节 2.3 和章节 2.4研究，我们进一步验证 OP-BMSCs 自噬水平下降导致的细胞功能衰退是骨质疏松状态下成骨能力不足的重要原因，因此，我们拟通过经皮超声介导雷帕霉素递送来激活自噬，调节成骨微环境，来进一步促进骨质疏松状态下的假体界面骨整合。  \n\n通过评估假体界面的骨整合强度，可以预测假体移位、松动发生的概率。影像学和组织学手段可以直观地观察到假体界面周围新生骨组织的长入情况。通过Micro-CT 和硬组织切片显示经皮超声介导雷帕霉素递送可以显著促进骨质疏松状态下的微孔假体表面的骨形成与长入，甚至可接近健康状态下的再生骨量水平。但假体植入最终诉求是获得植入的长期稳定性，因此，生物力学测试在评估骨整合效果中是不可或缺的。假体的力学推出测试进一步证明经皮超声介导雷帕霉素递送可以显著提高宿主骨-假体界面的结合力，表明具有优越的骨整合效果。这些结果表明，经皮超声介导的雷帕霉素递送可以显著促进 3D 打印微孔界面在骨质疏松状态下的骨形成和骨整合，从而减少假体植入后松动和移位等术后并发症的发生。  \n\n此外，除了假体松动和移位，假体周围骨折也是假体植入后一个重要的术后并发症，通常与关节置换术后假体周围的骨量和骨质情况有关 [232, 233]。通过Micro-CT 评估假体界面周围的松质骨和皮质骨的骨量和骨质，以及生物力学测试分析假体周围骨组织的抗折强度，可以预测假体周围骨折发生的概率。在本研究中，Micro-CT 结果显示经皮超声介导的雷帕霉素递送可以改善整个股骨远端的骨微观结构，增加局部的骨量，以及增加假体近端皮质骨的厚度和面积；同时，三点弯曲实验显示经皮超声介导的雷帕霉素递送可以显著提高假体周围骨组织的抗折强度。这些结果表明，经皮超声介导的雷帕霉素递送可以显著改善 3D 打印微孔界面周围的骨量和骨质情况，增加骨组织的抗折强度，从而减少假体植入术后假体周围骨折等并发症的发生。  \n\n既往研究已经证明，雷帕霉素可以通过抑制雷帕霉素敏感的 mTOR 靶点和激活BMP/Smad 信号，诱导干细胞向成骨细胞分化 [234]。此外，Qi 等人和 Ma 等人证明系统应用雷帕霉素可以通过增加骨密度、骨体积百分比、骨小梁数目和骨小梁厚度，有效减轻骨质疏松模型的骨丢失 [45, 196]。因此，在本研究中，为了探究经皮超声将雷帕霉素递送到微孔假体植入区域后，对局部自噬情况和成骨微环境的调控，我们进行了一系列的验证。通过对假体界面骨组织中的自噬关键蛋白分析显示，经皮超声将雷帕霉素递送可以显著抑制mTOR 蛋白的表达，（自噬体）膜型蛋白 LC3-II 比例升高，自噬降解蛋白 P62 降低，表明局部微环境中自噬启动，且保持通畅，可有效清除代谢废物。最后，从基因和蛋白层面进一步显示成骨相关标志物Runx-2、ALP、OCN 和OPN 表达上调，表明经皮超声将雷帕霉素递送改善了界面周围的成骨微环境，促进细胞成骨分化、诱导骨形成与长入，从而获得稳定的界面骨整合和改善的周围骨微观结构，为减少假体置换术后松动、移位和假体周围骨折等并发症的发生提供基础。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 122,
        "chunk": "# 2.5.5 小结  \n\n在假体植入后使用经皮超声介导的雷帕霉素递送策略具有良好的生物安全性，可以有效的激活假体界面周围微环境中的自噬活性，改善成骨微环境，从而获得良好的界面骨整合，并改善周围骨量和骨质情况，有效的减少假体置换术后松动、移位和假体周围骨折等并发症的发生。",
        "category": " Conclusions"
    },
    {
        "id": 123,
        "chunk": "# 2.6 本章总结  \n\n在本章研究中，我们设计了一种局部超声介的导雷帕霉素递送策略，以激活OP-BMSCs 的退化的自噬水平，从而恢复其下降的细胞活性，包括增殖、存活、迁移、形态和成骨分化能力，同时抑制 OP-BMSCs 潜在的成脂分化能力。更重要的是，在骨质疏松症动物模型体内假体植入术后使用超声介导的雷帕霉素递送可以显著提高的3D 打印钛合金假体界面的骨整合及假面周围的骨量和骨质，减少假体置换术后松动、移位和假体周围骨折等并发症的发生。总的来说，本研究证实了超声介导的雷帕霉素递送这种个性化的策略通过调节 OP-BMSCs 自噬来促进骨质疏松状态下的假体界面骨整合机制，为提高骨质疏松等特殊骨质不良人群人工假体的研发提供新的思路。",
        "category": " Conclusions"
    },
    {
        "id": 124,
        "chunk": "# 第 3 章  功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合  \n\n骨质疏松患者在关节置换术后更易发生假体松动、移位和假体周围骨折等严重并发症，其主要原因可能与 OP-BMSCs 自噬能力低下导致的增殖受限、成骨活性缺陷和成脂分化增加有关。个体化 3D 打印假体表面的微孔结构可以增强界面初始稳定性的同时促进骨长入，但受限于钛合金假体界面的生物惰性、微孔的孔隙较大及表面光滑等物理特征，不利于 BMSCs 粘附和增殖，难以负载可激活OP-BMSCs 自噬能力的成分，不利于 OP-BMSCs 增殖和成骨分化，无法达到高效骨整合的作用。自噬激活剂——雷帕霉素可以上调 OP-BMSCs 自噬水平，促进其增殖和成骨分化，从而加速骨质疏松状态下的骨再生。  \n\n本论文在第二章部分设计了一种经皮超声介导的雷帕霉素递送策略，可以有效的激活 OP-BMSCs 自噬活性，改善成骨微环境，成功地促进了假体界面骨整合。但是，通过特制的超声电导仪频繁的经皮给药，可能导致患者依从性差，且增加了经济和时间负担。因此，本章节我们试图构建一种“3D 打印金属微孔/水凝胶的生物活性界面”作为一站式植入物，以壳聚糖（CEC）、聚乙烯醇（PVA），纳米银线（AgNW）和硼砂制备的多功能水凝胶（CEC-PVA-AgNW）作为药物递送系统缓释雷帕霉素上调 OP-BMSCs 的自噬水平，并利于其在金属微孔表面的粘附、增殖，激发其成骨分化潜能，促进假体界面的骨整合。此外，除了假体界面的骨整合不良导致的松动、移位和假体周围骨折等严重并发症，假体周围感染也是导致植入手术失败不可忽视的因素。通过掺杂纳米银线赋予功能化水凝胶高效的抗菌性能，可以有效减少假体周围感染的发生率，进一步优化生物活性界面植入后的成功率（图 3.1）。  \n\n![](images/3b522aa2550c4ae3068ab9d01b857a0e323058ea56b559b8a148381964450f19.jpg)  \n图 3.1 功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合，同时抑制细菌引起的假体周围感染。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 125,
        "chunk": "# 3.1 水凝胶的制备与表征",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 126,
        "chunk": "# 3.1.1 实验仪器与材料",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 127,
        "chunk": "# 3.1.1.1 实验仪器  \n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器</td><td>上海秋佐科学仪器有限公司</td></tr><tr><td>LC-OES-60高速精密增力搅拌机</td><td>上海力辰邦西仪器科技有限公司</td></tr><tr><td>恒温水浴锅</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr><tr><td>MilliQ 纯水仪</td><td>美国MILLIPORE公司</td></tr><tr><td>冻干机</td><td>苏州安泰空气技术有限公司</td></tr><tr><td>高压灭菌锅</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n第 3 章  功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合  \n3.1.1.2 主要试剂  \n\n\n<html><body><table><tr><td colspan=\"2\">续表：</td></tr><tr><td>干燥箱</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr><tr><td>移液器</td><td>德国Eppendorf 公司</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海花潮电器有限公司</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>日本JEOL公司</td></tr><tr><td>流变仪</td><td>美国 TA Instruments-Waters LLC 公司</td></tr></table></body></html>  \n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>丙烯酸</td><td>广州西陇化工有限公司</td></tr><tr><td>氯化氢</td><td>北京化工厂有限责任公司</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>北京化工厂有限责任公司</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>北京化工厂有限责任公司</td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>北京化工厂有限责任公司</td></tr><tr><td>氯化铜</td><td>天津永盛精细化工有限公司</td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>国药集团化学试剂上海有限公司</td></tr><tr><td>聚乙烯醇（PVA)</td><td>美国 Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>聚乙烯基吡咯烷酮（PVPON)</td><td>美国 Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>PBS缓冲液</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>甘油</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>硼砂</td><td>北京化工厂有限责任公司</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 128,
        "chunk": "# 3.1.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 129,
        "chunk": "# 3.1.2.1 水凝胶的制备  \n\n1）N-羧乙基壳聚糖（ $N.$ -carboxyethyl chitosan, CEC）制备：将壳聚糖（ $2\\mathrm{g}$ ， $12.4\\mathrm{mmol})$ ）与丙烯酸（ $2.9\\mathrm{mL}$ , 42.6 mmol）溶解于 $100\\mathrm{mL}$ 去离子水中，并在 $50^{\\circ}\\mathrm{C}$ 的水浴中磁力搅拌72h。随后，滴加 NaOH 溶液调节体系pH 值至10–12。将上述所得溶液置于去离子水中透析（MWCO 14000）3 天，将产品冷冻干，获得 CEC 粉末备用；  \n\n2）纳米银线（Silver Nanowires, AgNW）制备：  \n\n在磁力搅拌下（ $260\\mathrm{rpm}$ ）将无水乙二醇（ ${5}\\mathrm{ml}$ ）加热至 $151.5^{\\circ}\\mathrm{C}1\\$ 小时。向体系中加入 含 $\\mathrm{CuCl}_{2}$ 的乙二醇溶液（ $(4\\mathrm{mmol}\\mathrm{L}^{-1},0.9\\mathrm{ml})$ ）。继续搅拌 $15\\mathrm{min}$ ，然后加入溶于乙二醇中的聚乙烯基吡咯烷酮（PVPON）溶液（ $(0.1\\mathrm{g},2.5\\mathrm{ml})$ ），然后注射溶有 $\\mathrm{AgNO_{3}}$ 的乙二醇溶液（ $(0.05\\mathrm{g},2.5~\\mathrm{ml})$ ），继续搅拌 $30~\\mathrm{min}$ ，待反应结束体系冷却至室温后， $2000\\mathrm{rpm}$ ， $5\\mathrm{min}$ 乙醇离心洗涤多次，获得 AgNW 待用；  \n\n3）CEC-PVA-AgNW 水凝胶合成：  \n\n将 $0.5\\mathrm{g}$ 聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol, PVA），CEC（ $\\left(0.025\\mathrm{g}\\right)$ ），琼脂糖（0.025g）和甘油（ $0.2~\\mathrm{ml}$ ）溶解在 $10~\\mathrm{ml}$ 去离子水中，将该混合物在 $90^{\\circ}\\mathrm{C}$ 磁搅拌下油浴 $2\\mathrm{h}$ ，然后向上述溶液中加入 $\\mathrm{AgNW}\\left(0.2\\mathrm{mg}\\mathrm{ml}^{-1}\\right)$ ），并继续搅拌 $15\\mathrm{min}$ 。最后，将 $10\\mathrm{mlNa_{2}B_{4}O_{7}}$ 溶液（ $\\boldsymbol{0.04\\mathrm{mol}\\mathrm{L}^{-1}}$ ）加入上述混合物中，通过搅拌约 $10\\mathrm{min}$ 即可获得 CEC-PVA-AgNW 水凝胶。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 130,
        "chunk": "# 3.1.2.2 水凝胶的流变性能测试  \n\n夹具使用直径为 $10~\\mathrm{mm}$ 的圆形平行板，间隙设置为 $1000~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 。在测试过程中，用盖子将水凝胶盖住避免水分蒸发致水凝胶干燥而影响测试结果。在时间扫描模式下，设置流变仪的频率为 $10\\mathrm{rad/s}$ ，应变为 $0.1\\%$ ，温度为 $25^{\\circ}\\mathrm{C}$ ；在应变扫描模式下，设置流变仪的频率为 $10\\mathrm{rad/s}$ ，应变在 $10{-}500\\%$ 范围内，温度为 $25^{\\circ}\\mathrm{C}$ 。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 131,
        "chunk": "# 3.1.2.3 水凝胶的微观结构表征  \n\n将获得的 CEC-PVA-AgNW 水凝胶冻干、脱模，在样本表面进行喷金处理后在扫描电子显微镜下进行观察水凝胶表面微观结构。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 132,
        "chunk": "# 3.1.2.4 水凝胶的自愈合与导电性  \n\n将两块完整的水凝胶用剪刀物理剪切成两半，将不同部分的水凝胶结合在一起，观察来自不同水凝胶的两个半部分的结合情况。除了机械自修复性能外，CEC-PVA-AgNW 水凝胶的导电性能自动修复情况通过连接发光二极管进行检测。  \n\n即将CEC-PVA-AgNW 水凝胶连接到具有发光二极管作为指示器的电路中，并通过电源点亮发光二极管。当水凝胶物理切割成两半时，二极管熄灭。随后，将分离的两半放在一起，观察发光二极管是否可以再次点亮。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 133,
        "chunk": "# 3.1.2.5 水凝胶的体外降解实验  \n\n通过记录水凝胶干态质量的变化来评估其体外降解率。首先，将 $100~\\mathrm{{mg}}$ 冻干水凝胶放入体外生理模拟液中（ $37^{\\mathrm{{\\circ}}}\\mathrm{C}$ ，PBS 缓冲液）。并在溶液中加入 $0.02\\mathrm{wt\\%}$ 叠氮化钠，用于抑制细菌生长。在预先设定的时间点收集PBS 中残存的水凝胶，冻干后计算质量损失。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 134,
        "chunk": "# 3.1.2.6 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 135,
        "chunk": "# 3.1.3 结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 136,
        "chunk": "# 3.1.3.1 CEC-PVA-AgNW 水凝胶合成  \n\n如图 3.2A 所示，我们成功制备了纳米结构的银线。为了赋予材料药物递送和骨再生性能，我们首先选择生物相容性聚合物制备具有多网络结构的水凝胶。简而言之，将 $\\mathrm{Na}_{2}\\mathrm{B}_{4}\\mathrm{O}_{7}$ 溶液添加到 PVA、CEC、琼脂糖、甘油和 AgNW 的混合溶液中，均匀搅拌后即可获得透明的导电超分子水凝胶（图 3.2B）。 通过扫描电子显微镜可观察水凝胶为互联多孔结构（图 3.2C）。如图3.2D 所示，水凝胶的骨架网络主要由 CEC-琼脂糖、CEC-PVA 和琼脂糖-PVA 之间的强氢键组成。由于PVA-硼砂-PVA 和 PVA-甘油-PVA 的动态反应，也形成了可逆网络。PVA 和 AgNW之间的静态氢键网络，可使导电 AgNW 均匀分散在水凝胶中。此外，在体外模拟液PBS 中，水凝胶可在 36-48 天内缓慢降解（图 3.3）。  \n\n![](images/2672aedfc85271061a160e9dbeb49483921f6cf9b171f1a8f457e1792b8d7683.jpg)  \n图 3.2（A）通过扫面电子显微镜观察 AgNW 的微观结构；（B）CEC-PVA-AgNW水凝胶合成外相；（C）通过扫面电子显微镜CEC-PVA-AgNW 水凝胶的微观结构；（D）CEC-PVA-AgNW 水凝胶成胶机理图示。  \n\n![](images/8ddf30a5c1cb5353b4c27cecbcfd2a6f314036939236dde5077ba7084a5ed0c3.jpg)  \n图 3.3 CEC-PVA-AgNW 水凝胶的降解曲线。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 137,
        "chunk": "# 3.1.3.2 CEC-PVA-AgNW 水凝胶多功能特性  \n\n首先，通过宏观实验观察水凝胶的自修复性能。如图 3.4A 所示，两块水凝胶分别用不同的颜色染色，然后用剪刀物理切割成两半后再将不同部分结合在一起，来自不同水凝胶的两个半部分可以在 5 min 后愈合。为了观察水凝胶的导电性，以及机械自修复之后的导电情况，我们将 CEC-PVA-AgNW 水凝胶连接到具有发光二极管作为指示器的电路中，并通过电源点亮二极管。当水凝胶物理切割成两半时，二极管熄灭。随后，将分离的两半放在一起，由于氢键在室温下可逆地结合和解离，二极管可以再次点亮（图 3.4B）。为了进一步定量证明水凝胶的自愈合特性，进行了流变学分析。如图 3.4C 所示，CEC-PVA-AgNW 水凝胶的储能模量（G’）和损耗模量（G’’）在低应变下保持恒定值，而随着应变的增强，它们可以在 $400\\%$ 的应变下相交。该交界点就是破坏水凝胶正常网络结构所需的临界值。根据 G’和 G’’随剪切应变的演变，我们将剪切应变在 $500\\%$ 和 $10\\%$ 之间交替变化，如图 3.4D 所示，水凝胶交替表现出高应变时的液体和低应变时的固体行为，机械性能几乎完全恢复到模量的原始值。  \n\n![](images/3f9c0f015b06fc45a492e818b0f0612746847336fc7c84efd0e2908d8e497e00.jpg)  \n图 3.4（A）将水凝胶切成两块后在环境条件下的自愈合图像；（B）自愈合水凝胶连接到二极管电路中恢复电导性的宏观照片；（C）PVA-NCECS-AG/AG NWs水凝胶在固定角频率（ $\\mathrm{\\Delta\\cdot10\\rad/s)}$ ）下的应变相关振荡剪切流变学；（d）使用交替的低（ $(10\\%)$ ）至高（ $50\\%$ ）剪切应变测量水凝胶的自愈合性能。每个应变间隔保持为100s，固定频率保持为 $10{\\mathrm{~rad/s}}.$ 。  \n\n随后，我们检测了水凝胶的透明性。如图 3.5A 所示，显示了具有不同浓度AgNW 的水凝胶在 $400{-}700~\\mathrm{nm}$ 波长范围内的光透射率。水凝胶的透明度可以通过改变 $\\operatorname{AgNW}$ 的浓度来改变。当 $\\operatorname{AgNW}$ 含量从 0 增加到 $0.2\\mathrm{mg/mL}$ 时，水凝胶在 $660\\mathrm{nm}$ 波长下的每毫米厚度的平均透射率从 $93\\%$ 降低到 $74\\%$ 。此外，当水凝胶覆盖在纸板上时，纸板上的“SKLJLU”文字清晰可见，表明其较高的透明度高（图3.5B）。此外，水凝胶的在不同环境中的智能响应性被进一步探究。如图 3-5C 所示，通过提高温度（ $90^{\\circ}\\mathrm{C}$ ）或超声刺激（ $20\\mathrm{min}.$ ）可破坏水凝胶网络结构。除了外加的物理刺激外，降低 pH（0.1M）或添加竞争性含二醇分子（如果糖、葡萄糖、多巴胺和维生素 B6）也可能快速触发水凝胶结构的破坏。这种刺激响应性能主要归因于 $\\mathrm{\\DeltaNa}_{2}\\mathrm{B}_{4}\\mathrm{O}_{7}$ 和PVA 之间形成可逆性质的硼酸盐（图 3.5D）。  \n\n![](images/fec0118895c56a7c236ea1284ba1611afc8bec4c1f0c456a4991bf2bb82fdc15.jpg)  \n图 3.5（A） 含不同浓度 AgNW（0, 0.05, 0.10, 0.15, $0.20~\\mathrm{mg/mL}$ ）的水凝胶的宏观透光图像；（B）含不同浓度 AgNW 的水凝胶在空气中的透光光谱；（C）由不同刺激（如加热、超声、果糖、葡萄糖、多巴胺、维生素 B6 和 HCl）触发的水凝胶的凝胶-溶胶相变；（D）水凝胶对不同刺激的多重响应机制示意图。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 138,
        "chunk": "# 3.1.4 讨论  \n\n在本章节中，我们通过将 $\\mathrm{Na}_{2}\\mathrm{B}_{4}\\mathrm{O}_{7}$ 溶液添加到PVA、CEC、琼脂糖、甘油和AgNW 的混合溶液中，获得了具有溶胀稳定、有序降解、自愈合、导电、透明和智能响应的多功能超分子水凝胶。该水凝胶的骨架网络主要由 CEC-琼脂糖、CEC-PVA 和琼脂糖-PVA 之间的强氢键（氢键 I）组成 [235]。这些强氢键允许水凝胶立即形成，并赋予超分子水凝胶稳定的机械性能。由于 PVA-硼砂-PVA 和PVA-甘油-PVA（氢键 II）的动态反应，也形成了可逆网络 [236]。此外，PVA 和AgNW 之间的静态氢键网络（氢键 III），可使导电 AgNW 均匀分散在水凝胶中。制备的水凝胶具有互联的多孔结构，可以保证营养和氧气运输，使细胞迁移和增殖，从而增强新组织的形成。众多氢键的形成，赋予了水凝胶较为致密的多孔结构，赋予了水凝胶潜在的药物递送能力 [237, 238]；而AgNW 的引入可能给水凝胶带来有力的抗菌性能 [239, 240]。对于骨生成，水凝胶的有序降解为骨向内长入多孔界面提供了空间。水凝胶在体外模拟液体 PBS 中可在36-48 天内缓慢降解。先前的研究报道，生物活性水凝胶植入后约 2-4 周发生血管生成和骨形成，本研究中获得的水凝胶的有序降解速率有利于为骨再生提供空间 [241]。  \n\n由于 PVA-硼砂 PVA 和 PVA-甘油-PVA 之间的动态氢键，赋予 CEC-PVA-AgNW 水凝胶优异的自修复性能，并可使重新愈合的水凝胶可以长时间保持结构的稳定性。除了机械自修复性能外，CEC-PVA-AgNW 水凝胶的导电性能可以自动修复。通过在系统中加入金属颗粒制备导电材料引起了研究人员的广泛关注，并在生物医学中具有潜在应用 [242-244]。在过去的几十年中，智能软材料因为其宏观结构和物理性能在响应特定刺激时表现出显著的变化，引起了越来越多的关注[245, 246]。通过上述水凝胶中的可逆键的存在，赋予了水凝胶作为刺激响应宏观结构的前景。这种刺激响应性能主要归因于 $\\mathrm{Na}_{2}\\mathrm{B}_{4}\\mathrm{O}_{7}$ 和 PVA 之间形成可逆性质的硼酸盐。更具体地说，基于硼酸盐的反应的平衡可以通过加热、超声波、降低 pH值和引入含二醇的分子来调节。自由分子中的二醇基团比 PVA 聚合物更具反应性，因此可作为PVA 的竞争对手与 $\\mathrm{Na}_{2}\\mathrm{B}_{4}\\mathrm{O}_{7}$ 反应 [247]。因此，超分子水凝胶在含有二醇基团的分子（如果糖、葡萄糖、多巴胺和维生素 B6）存在下解离和溶解。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 139,
        "chunk": "# 3.1.5 小结  \n\n我们通过将 $\\mathrm{Na}_{2}\\mathrm{B}_{4}\\mathrm{O}_{7}$ 溶液添加到 PVA、CEC、琼脂糖、甘油和 AgNW 的混合溶液中，成功制备了超分子水凝胶。获得的 CEC-PVA-AgNW 水凝胶具有稳定的有序降解性、自愈合能力、导电性、透明性、智能响应性，以及潜在的药物递送和抗菌性能。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 140,
        "chunk": "# 3.2 3D 打印生物活性界面制备、表征与抗菌性分析",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 141,
        "chunk": "# 3.2.1 实验仪器与材料",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 142,
        "chunk": "# 3.2.1.1 实验仪器  \n\n<html><body><table><tr><td>仪器 品牌</td></tr><tr><td>EBM机 瑞典 Arcam 公司</td></tr><tr><td>超净操作台 美国Airtech公司</td></tr></table></body></html>  \n\n3.2.1.2 主要试剂  \n\n\n<html><body><table><tr><td>细胞培养箱</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>上海比朗仪器制造有限公司</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>德国 Bruker 公司</td></tr><tr><td>冻干机</td><td>苏州安泰空气技术有限公司</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>日本JEOL公司</td></tr><tr><td>高效液相色谱-串联质谱仪</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>细菌培养试管</td><td>泰州市方格医疗器械有限公司</td></tr><tr><td>恒温震荡箱</td><td>上海一恒科学仪器有限公司</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>高压灭菌锅</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr><tr><td>冰箱</td><td>青岛海尔生物医疗股份有限公司</td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>青岛海尔生物医疗股份有限公司</td></tr><tr><td>干燥箱</td><td>上海昕仪仪器仪表有限公司</td></tr><tr><td>万能力学测试机</td><td>上海长肯试验设备有限公司</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海花潮电器有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>Ti6A14V粉末</td><td>北京爱康医疗</td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>美国 Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌（S.aureus）</td><td>ATCC</td></tr><tr><td>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)</td><td>ATCC</td></tr><tr><td>LB培养基</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>活/死细菌染色试剂盒</td><td>上海翌圣生物科技股份有限公司</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 143,
        "chunk": "# 3.2.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 144,
        "chunk": "# 3.2.2.1 3D 打印微孔假体的制备与表征  \n\n同章节 2.1。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 145,
        "chunk": "# 3.2.2.2 3D 打印生物活性界面的制备  \n\n在凝胶溶液混合前，将 $10\\mathrm{mlNa}_{2}\\mathrm{B}_{4}\\mathrm{O}_{7}$ 溶液（ $0.04\\mathrm{mol}\\mathrm{L}^{-1}$ ）溶液中预先加入放有3D 打印微孔假体的模具中，再往模具中加入含有雷帕霉素（ $54.85~\\mathrm{mg}$ ）的PVA（ $(0.5\\mathrm{g})$ ）、CEC（ $\\left(0.025\\mathrm{g}\\right)$ ）、琼脂糖（ $(0.025\\mathrm{g})$ ）、甘油（ $0.2{\\mathrm{ml}}$ ）和 AgNW（ $0.2\\mathrm{mg}$ $\\mathrm{ml}^{-1}$ ）混合溶液，搅拌 $15\\mathrm{min}$ ，使溶胶充分混合并浸入微孔内部并成胶，最终获得雷帕霉素终浓度为 $3~{\\upmu\\mathrm{M}}$ 的3D 打印生物活性界面。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 146,
        "chunk": "# 3.2.2.3 3D 打印生物活性界面微观结构观察  \n\n将获得的 3D 打印生物活性假体界面冻干、脱模，在样本表面进行喷金处理后在扫描电子显微镜下进行观察假体界面的微观结构。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 147,
        "chunk": "# 3.2.2.4 雷帕霉素药物释放分析  \n\n将负载雷帕霉素的生物活性界面置于在 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，含 $2~\\mathrm{ml}$ PBS 的玻璃瓶中，设置5 个平行瓶。在预定时间点，抽取 $2~\\mathrm{ml}$ PBS 并储存在- $80^{\\circ}\\mathrm{C}$ 冰箱中，再加入 2ml 新鲜 PBS。用高效液相色谱法（HPLC，检测波长为 $278~\\mathrm{nm}$ ）分析 PBS 中雷帕霉素的释放水平，其参数设定如下，流动相 A：三乙胺缓冲液/已腈/四氢呋喃$\\scriptstyle=96/3/1$ ，流动相 B：三乙胺缓冲液/已腈/四氢呋喃 $=70/29/1$ ，流速为 $1.0\\ \\mathrm{ml/min}$ ，检测波长为 $278~\\mathrm{nm}$ ，先行梯度洗脱。通过标准曲线计算样本浓度及药物累计释放量。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 148,
        "chunk": "# 3.2.2.5 细菌活死染色实验  \n\n取 $1~\\mathrm{ml}$ 初始菌液加入细菌培养试管，再加入 LB 液体培养基 $5~\\mathrm{ml}$ ，将试管放入恒温震荡箱中，设置温度为 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，转速为 $100\\mathrm{r/min}$ 。培养 $20\\mathrm{h}$ 后收集试管中培养液 $100\\upmu\\mathrm{l}$ ，进行细菌活死染色，具体步骤如下：  \n\n1）将1 体积的 DMAO 和2 体积的EthD-Ⅲ在离心管中充分混合均匀，加入8 体积的 $0.85\\%\\mathrm{NaCl}$ 得到 $100\\times$ 染色工作液；  \n\n2） $100\\upmu\\mathrm{l}$ 菌液中加入 $1\\upmu\\mathrm{l}$ 的 $100\\times$ 染色工作液，混合均匀，室温下避光孵育$15\\mathrm{min}$ ;  \n\n3）取 $10~\\upmu\\mathrm{l}$ 染色后的菌液滴加在载玻片上，并盖上盖玻片；  \n4）荧光显微镜下观察细菌活死情况。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 149,
        "chunk": "# 3.2.2.6 细菌增殖抑制实验  \n\n取 $1~\\mathrm{ml}$ 初始菌液加入细菌培养试管，再加入 LB 液体培养基 $5~\\mathrm{ml}$ ，将试管放入恒温震荡箱中，设置温度为 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，转速为 $100\\mathrm{r/min}$ 。分别在培养 0、2、4、12、20、40、60 和 $80\\mathrm{h}$ 后收集试管中培养液 $100\\upmu\\mathrm{l}$ 并转移到96 孔板中，使用酶标仪在 $600\\mathrm{nm}$ 波长测量菌液的吸光度。LB 液体培养基作为空白对照（NC）组，并绘制细菌生长曲线。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 150,
        "chunk": "# 3.2.2.7 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 151,
        "chunk": "# 3.2.3 结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 152,
        "chunk": "# 3.2.3.1 3D 打印生物活性界面构建与表征  \n\n通过前述方法，我们获得了同章节 2.1.3 同样参数的 3D 打印平板状和圆柱状的两种形状的钛合金微孔支架，即孔隙率为 $69.2{\\pm}0.9\\%$ ，孔径为 $796.0{\\pm}1.9\\upmu\\mathrm{m}$ ，抗压强度为 $48.0{\\pm}2.1\\mathrm{MPa}$ ，弹性模量为 $1.63{\\scriptstyle\\pm0.2\\mathrm{GP}}$ 。按照如图3.6A 所示制备3D打印生物活性界面，即将3D 打印微孔支架预先置于含有 $\\mathrm{Na}_{2}\\mathrm{B}_{4}\\mathrm{O}_{7}$ 溶液的模具中，再往模具中加入含有将雷帕霉素的 PVA、CEC、琼脂糖、甘油和 AgNW 混合溶液，搅拌 $15\\mathrm{min}$ ，即可获得雷帕霉素终浓度为 $3\\upmu\\mathrm{M}$ 的3D 打印生物活性界面（图3.6B）。如图3.6C 所示，在扫面电镜下可观察到微孔支架内部完全填充多孔互通结构的水凝胶网络，这表明复合生物活性假体界面的成功构建。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 153,
        "chunk": "# 3.2.3.2 3D 打印生物活性界面的药物释放曲线  \n\n作为一种药物递送系统，药物的持续稳定释放对于生物应用至关重要。如图3.6D 所示，我们记录了48 天内雷帕霉素在3D 打印生物活性界面中的释放曲线。前三天，雷帕霉素的累计释放量为 $18.77{\\scriptstyle\\pm2.13\\%}$ ，而随后的释放曲线逐渐稳定，  \n\n表明药物释放稳定且持续至第 36 天的释放量为 $78.16{\\pm}1.88\\%$ ，并在第 48 天总共释放 $80.13{\\pm}1.91\\%$ 封装药量。  \n\n![](images/acf1668a164d754f529a54d81c11fcab4b37765bdf2378877aa359c0e8ba3435.jpg)  \n图 3.6（A）3D 打印钛合金微孔支架与负载雷帕霉素的 CEC-PVA-AgNW 水凝胶构建的3D 打印生物活性界面的模式图；（B）平板状和圆柱状3D 打印生物活性界面外观；（C）通过扫描电子显微镜观察 3D 打印生物活性界面微观结构；（D）雷帕霉素在3D 打印生物活性界面中的药物释放曲线。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 154,
        "chunk": "# 3.2.3.3 3D 打印生物活性界面的抗菌性  \n\n在培养 $20\\mathrm{~h~}$ 后，活死染色图像显示在 NC 组和 pTi 组中培养的大多数 S.aureus 和MRSA 细菌保持存活，表明纯多孔钛合金微孔支架没有抗菌性能。而在水凝胶和负载雷帕霉素的水凝胶填充的多孔钛合金微孔支架中（即 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组和 pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组）中培养的细菌几乎死亡（图 3.7A、B）。定量分析显示，在NC 组、pTi 组、 $\\mathtt{p T i}\\ @\\mathtt{G e l}$ 组和 pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组中，S. aureus 的存活率分别为$95.36{\\pm}1.72\\%$ 、 $93.90{\\scriptstyle\\pm1.98\\%}$ 、 $14.50{\\pm}2.23\\%$ 和 $12.61{\\scriptstyle\\pm4.42\\%}$ （图 3.7C）；而 MRSA 的存活率为 $94.54{\\scriptstyle\\pm2.18\\%}$ 、 $93.98{\\pm}1.25\\%$ 、 $20.14{\\scriptstyle\\pm4.08\\%}$ 和 $19.02{\\pm}2.72\\%$ （图 3.7D）。此外，通过吸光度评估菌细增殖曲线表明，与 NC 组和pTi 组相比， $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组和 pTi-Rap@Gel 组在 80 小时内对 S. aureus（图 3.7E）和 MRSA（图 3.7F）细菌增殖具有较强的抑制作用。  \n\n![](images/50c76d05908548f66f8dbcb9057695fb8216be9129ff394f7f0af51b868e9094.jpg)  \n图 3.7（A）S. aureus 的 BacLight 死/活染色；（B）MRSA 的 BacLight 死/活染色;（C）定量分析 S. aureus 的存活率; （D）定量分析 MRSA 的存活率; （E） S.aureus 的增殖曲线; （F）MRSA 的增殖曲线（ $^{\\ast}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ; ${}^{***}p<0.001\\rangle$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 155,
        "chunk": "# 3.2.4 讨论  \n\n同章节 2.1 相同，我们利用 3D 打印技术制备孔径大小、形态和孔隙率可控，且微孔间互通性良好的仿生3D打印微孔钛合金支架。使用多功能化的CEC-PVA-AgNW 水凝胶作为雷帕霉素药物递送系统，与 3D 打印微孔钛合金支架复合成功构建了3D 打印生物活性界面。作为一种药物递送系统，药物的持续稳定释放对于生物应用至关重要。通过对 3D 打印生物活性假体界面在 48 天内雷帕霉素的释放分布曲线可知，在初始阶段雷帕霉素的释放速率稍快，而之后的释放曲线逐渐稳定且持续，表明该 3D 打印生物活性界面具有优良的缓释性能。初期阶段雷帕霉素较快的速释放可能与药物通过静电相互作用吸附在生物活性假体界面表面有关。随后，在稳定释放阶段，水凝胶的降解可能成为影响雷帕霉素释放的主要因素。CEC-PVA-AgNW 水凝胶的缓慢降解使雷帕霉素能够以稳定的方式持续释放 [155]。  \n\n此外，假体植入后，假体周围感染是导致植入术失败的一个主要原因。AgNW的引入赋予了生物活性界面独特的抗菌性能。银离子从超分子水凝胶的初始释放足以抑制试管中S. aureus 的增殖，并继续发挥抗菌作用。然而，MRSA 的抑菌曲线略有不同，即在12 小时的初始阶段，对MRSA 的抑制作用不如S. aureus 明显。  \n\n随着AgNW 释放量的增加，20 小时后细菌的吸光度降低，表明抗菌作用开始明显。值得注意的是，pTi 组的细菌增殖率高于 NC 组，这可能是由于多孔结构提供了利于细菌繁殖的场所 [248]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 156,
        "chunk": "# 3.2.5 小结  \n\n我们通过 EBM 技术成功制备了 3D 打印微孔钛合金支架，并将其与负载雷帕霉素的功能化CEC-PVA-AgNW 水凝胶复合，构建了具有药物缓释功能和良好抗菌性能的3D 打印生物活性界面。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 157,
        "chunk": "# 3.3 3D 打印生物活性界面激活 OP-BMSCs 自噬",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 158,
        "chunk": "# 3.3.1 实验仪器与材料",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 159,
        "chunk": "# 3.3.1.1 实验仪器  \n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>超净操作台</td><td>美国Airtech公司</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>日本 Olympus 公司</td></tr><tr><td>蛋白电泳及转膜仪</td><td>中国 Tanon公司</td></tr><tr><td>Clinx Science Instruments</td><td>上海勤翔科学仪器有限公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他仪器同 2.3.1.1。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 160,
        "chunk": "# 3.3.1.2 主要试剂  \n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>美国Invitrogen 公司</td></tr><tr><td>蛋白裂解液</td><td>北京全式金生物技术有限公司</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>北京全式金生物技术有限公司</td></tr><tr><td>5x蛋白上样缓冲液</td><td>北京鼎国昌盛生物技术有限公司</td></tr><tr><td>BCA蛋白浓度测定试剂盒</td><td>上海碧云天生物技术有限公司</td></tr><tr><td>Protein leader</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>美国Millipore公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>SDS-PAGE凝胶配制试剂盒</td><td>北京鼎国昌盛生物技术有限公司</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>北京鼎国昌盛生物技术有限公司</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td></tr><tr><td>目的蛋白一抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>标记二抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>Ad-McHery-GFP/LC3B</td><td>上海碧云天生物技术有限公司</td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>美国 Sigma-Aldrich 公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他试剂同 2.3.1.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 161,
        "chunk": "# 3.3.1.3 溶液配制  \n\n1）电泳缓冲液（1L）  \n\nSDS 1.0 g 甘氨酸 14.4 g Tris 3.0 g  \n\n2）电转缓冲液（1L）  \n\n甲醛 200 ml甘氨酸 14.4 gTris 3.0 g  \n\n3）TBST 溶液（ $500\\mathrm{ml}\\cdot$ ）  \n\nNaCl 4.09 g Tris 0.605 g Tween 20 0.5 ml  \n\n4）Western Blot 封闭液： $5\\%$ 脱脂奶粉  \n\n称取 1g 脱脂奶粉加入 20mlTBST 溶液中，置于摇床上摇匀。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 162,
        "chunk": "# 3.3.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 163,
        "chunk": "# 3.3.2.1 各组细胞的 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的蛋白水平检测  \n\nOP-BMSCs 的获取、培养与鉴定同章节 2.2。随后，通过 Western Blot 检测细胞中mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62 的蛋白表达水平，评估 3D 打印生物活性界面对细胞的自噬水平的影响，具体步骤如下：  \n\n1）将 OP-BMSCs 以 $1\\times10^{4}/$ 每孔种植在 12 孔板中，OP-BMSCs 不接受任何处理（NC 组）、与微孔支架共培养（pTi 组）、与填充 CEC-PVA-AgNW 水凝胶的微孔支架共培养（ $\\left(\\mathfrak{p}\\mathrm{Ti}\\ @\\mathrm{Gel}\\right.$ 组）和与填充负载雷帕霉素的 CEC-PVA-AgNW 水凝胶的微孔支架共培养（pTi-Rap $\\ @\\mathrm{Gel}$ 组）；  \n\n2）将接受不同处理3 天后的细胞收集并提取蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度，Western Blot 检测，具体步骤同章节 2.3.2.2；  \n\n3）使用 Image J 软件计算各条带灰度值，以 $\\upbeta$ -actin 为内参计算各组蛋白的表达量。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 164,
        "chunk": "# 3.3.2.2 Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞  \n\n1）为了分析不同条件下的自噬通量，将 OP-BMSCs 以 $1\\times10^{4}/$ 每孔种植在在6 孔培养板上，并在达到 $50\\%-60\\%$ 的融合时进行感染；  \n\n2）用 PBS 洗涤三次后，用浓度为 10 摩尔的表达 mCherry-GFP-LC3B 融合蛋白的腺病毒（Ad-mCherry-GFP/LC3B）感染细胞。 $24\\mathrm{h}$ 后， $4\\%$ 多聚甲醛固定，PBS 洗涤 3 遍，通过荧光显微镜观察 mCherry 和 GFP 的表达来显示自噬体和自噬溶酶体的变化。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 165,
        "chunk": "# 3.3.2.3 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 166,
        "chunk": "# 3.3.3 实验结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 167,
        "chunk": "# 3.3.3.1 自噬关键蛋白 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的表达水平  \n\n为了确认 OP-BMSCs 中自噬相关蛋白在 3D 打印生物活性界面中的变化，我们利用 Western Blot 技术检测了各组细胞中这些的蛋白表达水平。如图 3.8A 显示，NC 组中LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降、P62 表达水平增高，表明 OP-BMSCs 的自噬水平低下，而将细胞与 pTi 和pTi@Gel 共培养并不会逆转这种趋势。而通过与具有雷帕霉素缓释功能的 3D 打印生物活性界面共培养，可以发现 OP-BMSCs 的中的mTOR 蛋白表达受到显著抑制（图 3.8B），增加 LC3Ⅱ的形成和提高 LC3Ⅱ/Ⅰ比值（图3.8C），和减少 P62 表达（图3.8D），证明细胞自噬被激活。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 168,
        "chunk": "# 3.3.3.2 Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞观察自噬通量变化  \n\n如图 3.8E 所示，Ad-mCherry-GFP-LC3B 感染细胞后，mCherry 和 GFP 荧光融合形成的黄色斑点表明自噬体（白色箭头），其未与溶酶体融合。绿色荧光蛋白可以在酸性环境中降解，因此红色斑点代表与溶酶体融合的自噬体（红色箭头）。在NC 组和pTi 组中观察到的黄点和红点均较少，表明这两组中的 OP-BMSCs 中自噬活性水平较低。然而，在 pTi-Rap@Gel 组中，细胞中的自噬体形成增多（图3.8F），且自噬溶酶体也相应增多（图 3.8G），表明 3D 打印生物活性界面可以激活OP-BMSCs 的自噬，且保持通畅。  \n\n![](images/a8af6e09b30c5719c2dcc701d290c33565537375221da937c0748234dc0cc747.jpg)  \n图 3.8（A）Western Blot 显影条带及相应分子量， $\\upbeta$ -actin 为内参分子；（B-D）各组蛋白条带灰度值统计结果;（E）Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞，白色箭头表示自噬体，红色箭头表示自噬溶酶体；（F）定量统计高倍视野下自噬体数量；（G）定量统计高倍视野下自噬溶酶体数量（ ${}^{*}p<0.05$ ; $**_{p}<0.01\\dot{.}$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 169,
        "chunk": "# 3.3.4 讨论  \n\nBMSCs 是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。BMSCs 是在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞等多种分化潜能的细胞亚群，在骨损伤或者骨科假体植入后的骨再生和骨整合过程中发挥关键作用。基线水平的自噬活性可以维持BMSCs 的干性和分化能力。然而，在骨质疏松状态下，OP-BMSCs 的自噬水平低下、失衡，导致细胞衰老、数量减少和功能受损，可能是骨损伤后成骨能力不94  \n\n足的重要原因。  \n\n在第 2 章中我们已经证明通过超声介导的雷帕霉素递送可以有效激活 OP-BMSCs 的自噬水平，在本章节，我们通过改变药物递送的策略，即将药物通过水凝胶复合到微孔支架中，构建一个可以稳定释放雷帕霉素的 3D 打印生物活性界面。通过 Western Blot 评估自噬关键蛋白 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的表达和Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞观察自噬通量，证明 3D 打印生物活性界面可以有效的激活 OP-BMSCs 的自噬，并保持通畅。然而，相较于 NC 组和 pTi 组，pTi@Gel 组中的自噬体增多（图 3.8F），但是自噬溶酶体并没有相应的增多（图 3.8G），表明单纯的 CEC-PVA-AgNW 水凝胶对 OP-BMSCs 自噬可能具有潜在的影响，但并不能上调其整体的自噬水平，这一点通过对自噬关键蛋白mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的 Western Blot 检测也可证明，即这些蛋白的表达在 NC组、pTi 组和 pTi@Gel 组之间并无显著性差异。这些结果提示单纯的 CEC-PVA-AgNW 水凝胶加入并不会对细胞自噬产生实质性的影响，只有通过稳定释放雷帕霉素的3D 打印生物活性界面才可有效激活 OP-BMSCs 的自噬水平。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 170,
        "chunk": "# 3.3.5 小结  \n\n通过 Western Blot 评估自噬关键蛋白 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的表达和 Ad-mCherry-GFP-LC3B 双荧光腺病毒感染细胞观察自噬通量，证明 3D 打印生物活性界面可以有效的激活 OP-BMSCs 的自噬，并保持通畅。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 171,
        "chunk": "# 3.4 3D 打印生物活性界面调节 OP-BMSCs 功能",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 172,
        "chunk": "# 3.4.1 实验仪器与材料",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 173,
        "chunk": "# 3.4.1.1 实验仪器  \n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>超净操作台</td><td>美国Airtech 公司</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>日本 Olympus 公司</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>Transwell 孔板</td><td>美国Corning公司</td></tr><tr><td>PCR板</td><td>瑞士Roche 公司</td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>瑞士Roche 公司</td></tr><tr><td>分光光度计 NanoDrop 2000</td><td>美国Thermo 公司</td></tr></table></body></html>  \n\n其他仪器同 2.4.1.1。  \n\n3.4.1.2 主要试剂  \n\n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>CCK-8试剂盒</td><td>上海贝博生物科技有限公司</td></tr><tr><td>Calcein-AM/PI染色试剂盒</td><td>上海贝博生物科技有限公司</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>上海Aladdin 生化科技有限公司</td></tr><tr><td>Phalloidin-鬼笔环肽染色试剂盒</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>油红〇染色液</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>总 RNA提取试剂盒</td><td>上海Promega生物产品有限公司</td></tr><tr><td>RNA逆转录试剂盒</td><td>日本 Takara 公司</td></tr><tr><td>SYBR Green Master mix</td><td>瑞士Roche 公司</td></tr><tr><td>qPCR引物</td><td>上海生工生物有限公司</td></tr><tr><td>RT-qPCR试剂盒</td><td>北京全式金生物技术有限公司</td></tr><tr><td>茜素红染液</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>氯化十六烷基吡啶</td><td>美国 Sigma-Aldrich 公司</td></tr><tr><td>鼠抗兔Runx-2 抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>鼠抗兔ALP抗体</td><td>美国Abcamy公司</td></tr><tr><td>鼠抗兔OCN抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>鼠抗兔OPN抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>山羊抗兔Cy3荧光二抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 AlexaFluor?488 荧光二抗</td><td>美国 Thermo 公司</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>北京索莱宝生物科技有限公司</td></tr><tr><td>含 DAPI抗淬灭封片剂</td><td>美国Vector 公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他试剂同 2.4.1.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 174,
        "chunk": "# 3.4.1.3 溶液配制",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 175,
        "chunk": "# 1）免疫荧光封闭液  \n\n在 $20~\\mathrm{ml}$ PBS 中加入 $0.2{\\mathrm{~g~BSA}}$ ，置于水平摇床室温摇 $20~\\mathrm{min}$ ，再加入 200ul 山羊血清封闭液并混匀， $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 保存。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 176,
        "chunk": "# 3.4.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 177,
        "chunk": "# 3.4.2.1 CCK-8 法测试细胞增殖情况  \n\n将 pTi、pTi@Gel 和 pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 预先放置在 24 孔板中，然后将细胞以$1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在孔板中，OP-BMSCs 直接接种在平板中被视为对照 NC 组。在第1，4 和7 天时使用 CCK-8 试剂盒检测细胞增殖情况，具体操作如下：  \n\n1）在预定检测时间点，更换培养基后加入 $10\\%$ 体积的CCK-8 反应液；2）将 24 孔板放入 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 、 $5\\%\\mathrm{CO}_{2}$ 的孵箱中避光孵育 $2\\mathrm{h}$ ；3）取出 24 孔板，在每个样品中吸取 $100~\\upmu\\mathrm{l}$ 的液体转移到96 孔板；4）转移结束后，迅速将 96 孔板放置在酶标仪内检测各组 OD 值，检测波长为 $450\\ \\mathrm{nm}$ ；5）收集所得数据，进行统计分析。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 178,
        "chunk": "# 3.4.2.2 Calcein-AM/PI 细胞活死染色  \n\n将 pTi、pTi@Gel 和 pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 预先放置在 24 孔板中，然后将细胞以  \n$1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在孔板中，OP-BMSCs 直接接种在平板中被视为对照 NC 组。  \n在第3 天时使用 Calcein-AM/PI 试剂盒检测细胞活死情况，具体操作如下：1）配制染色工作液：Calcein-AM 工作液： $0.5\\operatorname{ml}\\mathrm{C}+10\\operatorname{ul}\\mathrm{A}+4.5\\operatorname{ml}$ 无菌去  \n离子水，PI 工作液： $0.5\\mathrm{ml}\\mathrm{C}+5\\mathrm{ul}\\mathrm{B}+4.5\\mathrm{ml}$ 无菌去离子水。2）细胞固定：吸取培养基， $4\\%$ 多聚甲醛溶液固定 $10~\\mathrm{min}$ ，PBS 清洗 3 次；3）每孔加入 $0.3{\\mathrm{ml}}$ Calcein-AM 工作液避光孵育 $15\\mathrm{min}$ ，随后避光环境下加  \n入PI 工作液 $0.3{\\mathrm{~ml}}$ 继续避光孵育 $5\\mathrm{min}$ ；4）而完成后迅速到暗室中，荧光显微镜下拍照观察。5）收集所得图片，Image J 分析细胞存活率。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 179,
        "chunk": "# 3.4.2.3 Phalloidin-鬼笔环肽染色  \n\n将 pTi、pTi@Gel 和 pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 预先放置在 24 孔板中，然后将细胞以$1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在孔板中，OP-BMSCs 直接接种在平板中被视为对照 NC 组。在第 3 天时使用 Phalloidin-鬼笔环肽试剂盒染色观察细胞形态，具体操作如下：  \n\n1）去除培养液，将细胞用 PBS 清洗3 次， $4\\%$ 多聚甲醛在室温下固定 $10\\mathrm{min}$ ；  \n2）去除固定液，PBS 清洗细胞3 次；  \n3）室温下， $0.5\\%$ 的 triton X-100 对细胞进行透化处理 $5\\mathrm{min}$ ，再次用PBS 清洗细胞3 次；  \n4）吸取 $300~\\upmu\\mathrm{l}$ 配置好的 Phalloidin-鬼笔环肽工作液加入孔板中，室温避光孵育 $30\\mathrm{min}$ ，PBS 清洗 3 次；  \n5）吸取 $300~\\upmu\\mathrm{l}$ 的DAPI 溶液（浓度 $100~\\mathrm{{nM}}$ ）对细胞核复染 $2~\\mathrm{min}$ ；  \n6）在荧光显微镜下进行观察并拍照，Image J 分析细胞荧光强度。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 180,
        "chunk": "# 3.4.2.4 茜素红染色  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在各组 24 孔板中，待细胞贴壁后换液，使用成骨诱导培养基，在成骨诱导后的第14 天和第21 天后进行茜素红染色，具体步骤如下：  \n\n1）去除培养基， $4\\%$ 多聚甲醛固定 $15\\mathrm{min}$ 后去除固定液，PBS 清洗3 次；2）将 PBS 完全吸净后，加入 $2\\%$ 茜素红 S 染色液 $0.3\\mathrm{\\ml}$ ，染色 $15~\\mathrm{min}$ ，去除染色液，PBS 洗涤 3 次；3）然后将染色好的细胞样品拍照，并放置在显微镜下进行观察；4）为半定量分析钙结节，孔板中加入氯化十六烷基吡啶 $0.6\\ \\mathrm{ml}$ ，并将孔板置于摇床上摇晃过夜，充分溶解沉积的钙结节。吸取孔中上清液转移到 96 孔板中，使用酶标仪在 $570\\mathrm{nm}$ 波长评估各组样品的吸光度。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 181,
        "chunk": "# 3.4.2.5 RT-qPCR  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在各组 24 孔板中，待细胞贴壁后，更换成骨诱导培养基，在成骨诱导 14 天和21 天后，通过 1）总RNA 的提取；2）总RNA浓度测量；3）逆转录合成 cDNA；及 4）RT-qPCR 分析细胞中 Runx-2、ALP、OCN 和 OPN 的基因表达情况，具体步骤同章节 2.4.2.7。采用 $2^{-\\Delta\\Delta\\mathrm{Ct}}$ 计算方法，98  \n\n各引物信息见表2.1，以 $\\upbeta\\cdot$ -actin 为内参。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 182,
        "chunk": "# 3.4.2.6 油红 O 染色  \n\n将细胞以 $1\\times10^{4}/$ 孔的密度种植在各组 24 孔板中，待细胞贴壁后，更换成脂诱导培养基培养 14 和 21 天，进行油红 O 染色观察细胞内成脂情况，具体步骤如下：  \n\n1）待细胞贴壁后更换成脂诱导培养基 A 液进行培养，3 天后换用成脂诱导培养基B 液进行培养 $24\\mathrm{h}$ ，如此A、B 培养基交替使用培养至第 14 和21 天；2） $10\\%$ 多聚甲醛固定细胞 $10\\mathrm{min}$ ，弃去固定液，PBS 洗涤，加入油红 O 染色液 $400~\\upmu\\mathrm{l}$ 孵育 $30~\\mathrm{min}$ ，移除油红 O 染液，并用 PBS 洗涤 2 次，光镜下观察；3）使用甲醇洗脱染色 $30\\mathrm{min}$ ，并使用酶标仪在 $510\\mathrm{nm}$ 处测量吸光度进行定量。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 183,
        "chunk": "# 3.4.2.7 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 184,
        "chunk": "# 3.4.3 结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 185,
        "chunk": "# 3.4.3.1 细胞增殖与活性  \n\n为了探究 3D 打印生物活性界面缓释雷帕霉素对 OP-BMSCs 增殖和存活的影响，我们使用 CCK-8 法、Calcein-AM/P 染色和鬼笔环肽染色对各组中的细胞情况进行分析。图 3.9A 所示，在培养到第 7 天时，pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组中的 OP-BMSCs 增殖速率显著高于 $\\mathtt{p T i}\\ @\\mathbf{Gel}$ 组（ $\\scriptstyle\\cdot\\mathtt{p}^{<0.05)}$ ）、pTi 组（ $\\cdot\\mathrm{p}{<}0.05$ ）和 NC 组（ $_{\\cdot\\mathrm{{p}<0.01}})$ ）。随后，Calcein-AM/PI 染色对活死细胞的标记显示，与 pTi-Rap@Gel组相比，NC 组、pTi 组和 $\\mathtt{p T i}\\ @\\mathtt{G e l}$ 组中可见更多红染的死细胞（图 3.9B）。如图3.9C 所示，对 Calcein-AM/PI 染色的定量分析显示 pTi-Rap@Gel 组中的细胞存活率显著高于其余 3 组（ $\\cdot\\mathrm{p}{<}0.05\\$ ）。Phalloidin-鬼笔环肽染色显示与 NC 组、pTi 组和 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组相比，pTi-Rap@Gel 组中的 OP-BMSCs 显示出更好的铺展状态和更多的板足延伸，细胞骨架沿长轴排列并具有更强的荧光强度（图 3.9D、E）。  \n\n![](images/df99f7a43ed5fb38563d07c653707611b35ab6efe21ce4345bc6506767df8721.jpg)  \n\n图 3.9（A）CCK-8 法检测细胞增殖情况；（B）Calcein-AM/PI 染色标记活死细胞；（C）定量分析细胞存活率；（D）Phalloidin-鬼笔环肽染色图像；（E）定量分析Phalloidin-鬼笔环肽染色荧光强度（ $^{*}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01\\$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 186,
        "chunk": "# 3.4.3.2 细胞成骨分化  \n\n为研究 3D 打印生物活性界面对 OP-BMSCs 成骨分化能力的影响，我们首先通过茜素红染色评估细胞中钙结节沉积情况，如图 3.10A 所示，在第 14 天时NC组、pTi 组和 pTi@Gel 组中的钙沉积均较少，但是 pTi-Rap@Gel 组已有肉眼可见明显的细胞矿化基质形成，这种差异在第 21 天时仍明显存在。此外，如图 3.10B所示，通过氯化十六烷基吡啶洗脱平板上和支架微孔内着色的钙结节，通过半定量分析进一步验证相比于 NC 组、pTi 组和 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组，该 3D 打印生物活性界面可以显著促进OP-BMSCs 的矿化形成（ $\\cdot\\mathrm{\\ttp}{<}0.05)$ ）。  \n\n随后，我们通过 PCR 实验分析各组细胞样品中成骨相关基因的表达水平。如图 3.10C、D，早期成骨标志物 ALP 和 Runx-2 在 pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组中的表达无论是在第 14 天还是第 21 天都显著高于其余 3 组（ $\\mathsf{p}{<}0.05\\rangle$ ）。而晚期成骨标志物OCN 和 OPN 的表达情况略有差异。如图 3.10E，在 pTi-Rap@Gel 组中 OCN 的表达至第21 天时才显著高于其余 3 组（ $(\\mathtt{p}{<}0.05)$ ）；而 OPN 的表达在第 14 天时相较于NC 组上调（ $(\\mathtt{p}{<}0.05)$ ），至第21 天时才显著高于其余3 组（ $\\cdot\\mathrm{p}{<}0.05\\$ ）（图3.10F）。  \n\n由此可见，3D 打印生物活性界面可以通过促进钙结节沉积和上调成骨相关基因的表达，显著激活 OP-BMSCs 成骨分化能力。  \n\n![](images/90577c679c13417657a6ddbc17c1f44cb479199be78eaccac2ed383006a4d1d6.jpg)  \n图3.10（A）茜素红染色图像；（B）茜素红染色半定量分析；(C-F) PCR 检测成骨相关基因 ALP、Runx-2、OCN 和 OPN 的表达（ $^{*}p<0.05)$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 187,
        "chunk": "# 3.4.3.4 细胞成脂分化  \n\n对细胞进行成脂诱导分化 14 和 21 天后，进行油红 O 染色观察 OP-BMSCs成脂分化的趋势（图 3.11A）。如图3.11B 所示，在第 14 天时，NC 组、pTi 组和$\\mathtt{p T i}\\ @\\mathrm{Gel}$ 组中的脂滴数量增加，显著高于 pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组（ $\\cdot\\mathtt{p}^{<0.05)}$ ）；在第 21 天时这种差异更显著（ $\\scriptstyle({\\mathfrak{p}}<0.01)$ ）。这些结果表明 3D 打印生物活性界面可以显著地抑制 OP-BMSCs 成脂分化。  \n\n![](images/b40cae687e45b11481f292f1e2c117df964aa6dd4bad5cc27fb2f5691e52529c.jpg)  \n图3.11（A）油红 O 染色图像；（B）油红O 染色定量分析（ $^{*}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 188,
        "chunk": "# 3.4.4 讨论  \n\n既往研究及本研究第二章部分证明在骨质疏松症骨髓中的OP-BMSCs 增殖、活性和迁移能力受到抑制，细胞功能衰退，成骨分化能力不足而成脂分化潜能增加。细胞活力和功能的衰退延缓了干细胞在骨损伤部位的募集和成骨分化，从而导致骨修复受损 [209]。且这些现象被证明与 OP-BMSCs 的低下的自噬水平有关[210, 211]。在本论文的第二章，我们设计了一种经皮超声介导的雷帕霉素递送策略，可以有效的激活 OP-BMSCs 自噬活性，改善成骨微环境。为了开发一种更便捷的可替代策略，我们构建一种了由 3D 打印金属微孔假体和负载雷帕霉素的水凝胶构成的“3D 打印生物活性界面”作为一站式植入物，并成功地通过缓释雷帕霉素上调 OP-BMSCs 的自噬水平。在本章节，我们验证了被激活自噬之后 OP-BMSCs 的细胞增殖、活性和多向分化潜能。  \n\n随着培养时间的延长，OP-BMSCs 在 NC 组、pTi 组和 pTi@Gel 组中的增殖较缓慢，而与3D 打印生物活性界面共培养的 OP-BMSCs 增殖能力显著提升，且具有更好的细胞存活率和更具铺展性的细胞骨架形态。除了促进细胞增殖和活性外，更重要的是，3D 打印生物活性界面可以通过促进钙结节沉积和上调成骨相关基因（ALP、Runx-2、OCN 和 OPN）的表达，显著激活 OP-BMSCs 成骨分化能力，且同时抑制 OP-BMSCs 成脂分化。BMSCs 被认为是骨损伤或者骨科假体植入后参与骨修复的成骨细胞的主要来源，BMSCs 的成骨分化是假体界面骨整合过程中的关键性事件。然而，骨质疏松微环境中的 BMSCs 数量不足，部分丧失了自我更新和成骨分化能力。此外，在雌激素缺乏的骨质疏松微环境中，OP-BMSCs 具有潜在分化为脂肪细胞而不是成骨细胞的趋势，会进一步导致骨丢失和脂肪积聚 [217, 218]。因此，我们构建的 3D 打印生物活性界面成功地调节 OP-BMSCs 成骨-成脂分化的平衡，为促进骨质疏松症患者假体植入后增强界面骨整合提供了潜在的替代策略。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 189,
        "chunk": "# 3.4.5 小结  \n\n具有雷帕霉素缓释功能的3D 打印生物活性界面可以有效地提高OP-BMSCs的增殖、存活和成骨分化能力，且抑制其成脂肪分化的趋势。这种 3D 打印生物活性界面的构建策略，通过恢复衰老 OP-BMSCs 的细胞功能，有望为骨质疏松症患者假体植入后界面骨整合提供替代策略。",
        "category": " Conclusions"
    },
    {
        "id": 190,
        "chunk": "# 3.5 3D 打印生物活性界面促进骨质疏松状态下假体界面骨整合",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 191,
        "chunk": "# 3.5.1 实验仪器与材料  \n\n3.5.1.1 实验仪器   \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>比利时 Bruker 公司</td></tr><tr><td>硬组织切片机</td><td>德国Leica 公司</td></tr><tr><td>冰冻切片机</td><td>德国Leica公司</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>日本 Olympus 公司</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr><tr><td>万能力学测试机</td><td>日本 Shimadzu 公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他仪器同 2.5.1.1。  \n\n3.5.1.2 主要试剂  \n\n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>碘伏毒液</td><td>山东利尔康医疗科技有限公司</td></tr><tr><td>兽用青霉素</td><td>华北制药集团有限责任公司</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>苏木精和伊红（H&E）染料</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>马松染料</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td></tr><tr><td>小鼠抗Runx-2抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>兔抗 ALP 抗体</td><td>美国Abcamy公司</td></tr><tr><td>小鼠抗OCN抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>兔抗OPN抗体</td><td>美国Abcam公司</td></tr><tr><td>山羊抗兔Cy3荧光二抗</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 AlexaFluor?488 荧光二抗</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>北京索莱宝生物科技有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>含DAPI抗淬灭封片剂</td><td>美国Vector公司</td></tr><tr><td>其他试剂同2.5.1.2。</td><td></td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 192,
        "chunk": "# 3.5.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 193,
        "chunk": "# 3.5.2.1 骨质疏松兔股骨远端假体植入和组织获取  \n\n使用双侧卵巢切除术制备骨质疏松动物模型，同章节 2.5.2.1。卵巢切除术后10 个月骨质疏松模型建立，植入 3 种不同的 3D 打印微孔假体至兔左侧股骨远端外侧髁，即 3D 打印微孔支架（pTi 组）、填充 CEC-PVA-AgNW 水凝胶的 3D 打印微孔支架（ $\\left({\\mathfrak{p}}\\mathrm{Ti}@\\mathrm{Gel}\\right.$ 组）和填充负载雷帕霉素的 CEC-PVA-AgNW 水凝胶的3D打印微孔支架（pTi-Rap@Gel 组）。具体假体植入手术操作步骤同章节 2.5.2.1。动物实验共分为 3 个组，每组 8 只。所有动物在处死前第 14 天和第 4 天肌肉注射钙黄绿素（ $(8~\\mathrm{mg/kg})$ ），以检测骨形成过程中的矿物质沉积率。术后第 12 周，过量麻醉法处死实验动物，收集左侧股骨样本，并将其固定在 $4\\%$ 多聚甲醛中或储存在- ${\\cdot}80^{\\circ}\\mathrm{C}$ 冰箱中，用于进一步研究。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 194,
        "chunk": "# 3.5.2.2 H&E 染色  \n\n收集动物内脏，进行H&E 染色以评估3D 打印生物活性界面植入的安全性。具体步骤同章节2.5.2.2。制备好切片行H&E 染色后显微镜镜检，图像采集分析。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 195,
        "chunk": "# 3.5.2.3 Micro-CT 评估骨长入  \n\n使用Micro-CT 对收集的股骨远端组织进行扫描，工作参数设置为电压：90V，电流： $114~\\upmu\\mathrm{A}$ ，扫描分辨率： $18~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ，并选用 $\\mathsf{A l/C u}$ 滤片以避免金属伪影。具体步骤同章节 2.5.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 196,
        "chunk": "# 3.5.2.4 硬组织切片评估骨整合效果  \n\n收集股骨远端样本，制备未脱钙硬组织切片，马松染色观察再生骨组织与假体微孔界面整合情况，具体步骤如下：  \n\n（1）样本固定脱水及硬切片制备同章节 2.5.2.4；  \n\n（2）有机溶剂脱去有机树脂，无菌水冲洗，Weigert 氏苏木素染液染 $20\\mathrm{min}$ ，并流水冲洗 $10\\mathrm{min}$ ；使用Masson 代丽春红-复红染料染色 $10\\mathrm{min}$ ；104  \n\n（3）滤纸吸干染液，将切片置于 $0.5\\%$ 冰醋酸分色处理 $1~\\mathrm{min}$ ，蒸馏水洗涤后用亮绿-冰醋酸染色 $5\\mathrm{min}$ ；  \n\n（4）放入二甲苯中两次，其浓度为 $10\\%$ ，透明后置于载玻片上用加拿大胶封固。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 197,
        "chunk": "# 3.5.2.5 力学测试评估界面骨整合与周围骨质情况  \n\n1）支架推出实验评估假体-骨界面的整合强度，具体步骤同章节 2.5.2.5 中1）。  \n\n2）三点弯曲实验评估周围骨质强度，具体步骤同 2.5.2.5 中2）。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 198,
        "chunk": "# 3.5.2.6 界面周围骨质中 mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和 P62 的蛋白水平检测  \n\n在力学测试推出支架后，收集假体界面周围骨质，通过 Western Blot 检测骨质中mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62 的蛋白水平，以评估假体界面周围的自噬情况。具体步骤同章节 2.5.2.6。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 199,
        "chunk": "# 3.5.2.7 界面周围骨质中成骨相关基因检测  \n\n在力学测试推出支架后，收集假体界面周围骨质，通过 RT-qPCR 法检测骨质中成骨相关基因 ALP、Runx-2、OCN 和 OPN 的表达水平。具体步骤同章节2.5.2.7。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 200,
        "chunk": "# 3.5.2.8 界面周围骨质中成骨相关蛋白免疫荧光染色  \n\n在力学测试推出支架后，收集股骨远端样本，通过免疫荧光染色检测骨质中成骨相关蛋白 ALP、Runx-2、OCN 和 OPN 的表达水平。具体步骤同章节 2.5.2.8。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 201,
        "chunk": "# 3.5.2.9 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 202,
        "chunk": "# 3.5.3 结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 203,
        "chunk": "# 3.5.3.1 3D 打印生物活性界面植入体内安全性分析  \n\n为了探究3D 打印生物活性界面植入体内的安全性，我们收集动物主要脏器，包括心、肝、脾、肺和肾，进行 H&E 染色。钛合金材料被认为是骨科的理想材料，具有较好的生物相容性，已被广泛应用于临床。如图3.12 显示，与微孔钛合金 pTi 组相比，植入 3D 打印生物活性界面后动物主要脏器的组织形态学结构并未发生显著改变，均显示保持正常的组织形态，表明 3D 打印生物活性界面在体内具有良好的安全性。  \n\n![](images/6783f1c344232a4c6da3a18d1046ed2387b2067f2295c09d814faada8c957da1.jpg)  \n图3.12 主要脏器，包括心、肝、脾、肺和肾的 H&E 染色。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 204,
        "chunk": "# 3.5.3.2 影像学评估假体界面骨整合效果  \n\n图 3.13A 所示，将 Micro-CT 所得图像进行 3D 重建可见与 pTi 组和 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组相比，pTi-Rap@Gel 组中假体表面和孔隙中具有更多的骨组织（黄色）形成。将假体所在的圆柱形区域设为感兴趣区域，进一步的骨形态计量分析显示pTi组、$\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组和 pTi-Rap@Gel 组的 BV/TV 值分别为 $14.1{\\pm}3.6\\%$ 、 $14.6{\\pm}3.3\\%$ 和$19.4{\\pm}2.0\\%$ 。与 pTi 组和 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组相比，pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组在假体植入后 12 周时表现出明显增加的骨体积分数（BV/TV， $\\mathsf{p}{<}0.05\\AA)$ ）、骨小梁数量（Tb.N， $\\mathsf{p}{<}0.01$ ）和骨小梁厚度（Tb.Th， $\\mathsf{p}{<}0.05\\AA)$ ），并降低了骨小梁分离度（Tb.Sp， $\\scriptstyle\\mathbf{p}<0.05.$ ）（图3.13B-E）。这些结果表明，3D 打印生物活性界面可以有效促进骨质疏松状态下的微孔假体表面的骨形成与长入。  \n\n![](images/f7fa34d853ac1943d0362a60a366887f9311c188def8d793ac745ba17d9ef440.jpg)  \n\n图3.13（A）Micro-CT 3D 重建图像，白色为支架，黄色为骨组织；（B-E）根据Micro-CT 结果定量分析 BV/TV，Tb.Th，Tb.N 和 Tb.Sp 参数（ ${\\displaystyle:*_{p}<0.05}$ ; $\\ast\\ast_{p}<$ 0.01）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 205,
        "chunk": "# 3.5.3.3 组织学评估假体界面骨形成与整合效果  \n\n为了观察周围骨组织与假体界面的骨形成与整合效率，我们制备不脱钙硬组织切片，并在荧光显微镜下直接观察钙黄绿素荧光双标图像（图3.14A）。动态组织形态计量分析表明，与 pTi 组和 pTi@Gel 组相比，pTi-Rap@Gel 组加快了骨缺损区域的新骨形成速率，如 MAR，MS/BS，BFR/BS 显著增加（图 3.14B-D）。随后将硬组织切片进行马松染色观察骨整合情况。如图 3.14E 所示，pTi 组和pTi@Gel 组的骨再生有限，只有少量骨组织结合到假体界面上；而在 pTi-Rap@Gel 组中可见再生骨与假体界面形成较为致密的结合，并长入表面微孔结构内部。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 206,
        "chunk": "# 3.5.3.4 力学评估假体界面骨整合效果  \n\n为了进一步验证假体界面和宿主骨之间的骨整合强度，我们进行了生物力学测试来记录支架推出时的峰值力。pTi 组、pTi@Gel 组和 pTi-Rap@Gel 组的支架推出力峰值分别为 $209.58{\\pm}31.74\\mathrm{N}.234.86{\\pm}52.26\\mathrm{N}$ 和 $417.07{\\scriptstyle\\pm58.95\\mathrm{N}}($ （图 3.14F）。力学测试结果与影像学和组织学评估结果一致，即新骨生成量和骨长入与假体界面骨整合强度成正比。这些结果表明，3D 打印生物活性界面有利于促进在骨质疏松状态下的骨形成和骨整合，从而减少假体植入后松动和移位等术后并发症的发生。  \n\n![](images/61fec0a3d05c40766486882e94d539898ed6ffb77034f0d84552415ceaeeed57.jpg)  \n\n图3.14（A）不脱钙硬组织切片观察钙黄绿素荧光双标；（B-D）通过钙黄绿素荧光双标对MAR、MS/BS 和BFR/BS 进行定量统计；（E）马松染色观察假体界面骨长入与整合（黑色区域表示假体，蓝色区域表示骨组织）；（F）植入 12 周后通过生物力学测试评估骨整合（ $^{*}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ; ${***p}<0.001\\rangle$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 207,
        "chunk": "# 3.5.3.5 假体界面周围骨量与骨质情况分析  \n\n除了假体界面的骨整合，假体界面周围的骨量与骨质的提高对于术后关节假体使用寿命也是至关重要的。通过 Micro-CT 扫描获得的股骨远端代表性横断面图像表明，与pTi 组和 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组相比，pTi-Rap@Gel 组的假体远端具有更致密的骨小梁结构，而假体近端具有更厚的皮质骨（图 3.15A）。如图3.15B 所示，选取股骨远端 $2\\ \\mathrm{cm}$ 区域（包含假体）为感兴趣区域，pTi 组、 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组和 pTi-Rap@Gel 组的 BV/TV 值分别为 $24.93{\\scriptstyle\\pm4.22\\%}$ 、 $27.33{\\scriptstyle\\pm4.16\\%}$ 和 $36.12{\\scriptstyle\\pm6.73\\%}$ 。此外，对骨小梁微观结构的分析同样显示相比于pTi 组和 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组，pTi-Rap@Gel组假体界面周围松质骨的和 Tb.N（图 3.15C）和 Tb.Th（图 3.15D）显著增加，Tb.Sp（图 3.15E）显著降低。  \n\n另外选取假体近端水平及近处 1 cm 区域为感兴趣区域分析皮质骨厚度（Ct.Th）和皮质骨面积（Ct.Ar）。如图 3.15F 所示，pTi-Rap@Gel 组的 Ct.Th 和Ct.Ar 参数明显优于 pTi 组和 $\\mathtt{p T i}\\ @\\mathtt{G e l}$ 组（ $\\cdot\\mathtt{p}^{<0.01}\\$ ）。随后，三点弯曲实验被用于进一步验证假体周围骨质的抗折强度（图 3.15G）。在 pTi-Rap@Gel 组的远端股骨中观察到明显更大的最大失效载荷，其约为 pTi 组和 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组的 1.33 倍和1.25 倍。这些结果显示具有雷帕霉素缓释功能的 3D 打印生物活性界面可显著改善假体界面周围骨量和骨质，并有望减少在骨质疏松模型中假体植入后假体周围骨折的发生率。  \n\n![](images/d340da1b93c69d01a94d4255608a6dde4cb368a1bbb412eb86a6749b66f118c2.jpg)  \n第 3 章  功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送通过激活自噬和调控成骨微环境促进骨质疏松状态下假体界面骨整合  \n图3.15（A）Micro-CT 观察假体界面远段和近端的骨量和骨质情况；（B-E）股骨远端 $2\\ \\mathrm{cm}$ 区域（包含假体）的骨形态学参数分析，包括 BV/TV、Tb.Th、Tb.N和 Tb.Sp；（F）假体近端水平及近处 1 cm 区域皮质骨参数分析，包括 Ct.Th 和Ct.Ar；（G）生物力学三点弯曲实验分析该节段骨的抗折强度（ $^{\\cdot}\\ast_{p}<0.05$ ; $^{**}p<$ 0.01）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 208,
        "chunk": "# 3.5.3.6 假体界面周围自噬激活情况  \n\n为了研究 3D 打印生物活性界面增强骨质疏松状态下骨整合的体内机制，我们收集了假体界面表面和孔隙中的骨组织，通过 Western Blot 检测自噬通路关键蛋白以评估局部骨组织中的自噬水平（图 3.16A）。结果表明，3D 打印生物活性界面可显著抑制假体周围组织中mTOR 表达（图3.16B），激活LC3 II/I（图3.16C），并清除累积的 P62 蛋白（图 3.16D），从而上调骨质疏松状态下假体界面周围的自噬活性。  \n\n![](images/be8bb2a8d4f23f9d8256ce96df927528c91546c6561ae82014d4baa2025e5160.jpg)  \n图 3.16（A）Western Blot 显影条带及相应分子量， $\\upbeta$ -actin 为内参分子；（B-D）各组蛋白条带灰度值统计结果（ $^{*}p<0.05$ ; $**_{p}<0.01\\dot{.}$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 209,
        "chunk": "# 3.5.3.7 假体界面周围成骨标志物表达分析  \n\n收集 3D 打印假体表面、孔隙中以及邻近假体界面的骨组织，通过 RT-qPCR检测和免疫荧光染色以分析局部微环境中的成骨标记物表达情况。如图3.17A 所示，RT-qPCR 分析显示与 pTi 组和 $\\mathtt{p T i}\\ @\\mathtt{G e l}$ 组相比，pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组中的成骨相关基因 Runx-2、ALP、OCN 和 OPN 的表达水平显著提高（ $\\cdot\\mathrm{\\ttp}^{<0.05)}$ ）。随后，对脱钙骨组织进行免疫荧光染色以评估周围骨组织中成骨相关蛋白的表达（图3.17B）。如图 3.17C 所示，荧光强度的定量分析显示，相较于 pTi 组和 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组，植入 3D 打印生物活性界面后显著增加了假体界面周围Runx-2、ALP、OCN和 OPN 的表达（ $_{(\\mathrm{p}<0.01)}$ ）。这些结果显示 3D 打印生物活性界面能够显著促进骨质疏松状态下界面周围骨组织中成骨标记物的表达。  \n\n![](images/2f69ee499e19c0550fbd2c491932f7aff27ea6f87c42834ea11f47a53444a50f.jpg)  \n图 3.17（A）RT-qPCR 分析成骨相关基因 Runx-2、ALP、OCN 和 OPN 在假体界面周围骨组织中的表达情况；（B）假体界面周围骨组织的 Runx-2、ALP、OCN和OPN 免疫荧光染色；（C）定量分析成骨相关蛋白的荧光强度（ $^{*}p<0.05$ ; $\\ast\\ast_{p}$ $\\phantom{+}<0.01\\$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 210,
        "chunk": "# 3.5.4 讨论  \n\n接受关节置换术的患者常常伴随有骨质疏松症，这类患者骨再生能力受限，常导致假体界面骨整合不足，以及周围骨量低、骨质差，面临植入术后假体移位和松动以及假体周围骨折等灾难性并发症的风险。考虑到 OP-BMSCs 低下的自噬水平可能是骨质疏松状态下低下的骨再生与骨整合不足的重要原因，使用经典的自噬激活剂——雷帕霉素来促进假体界面骨整合是一个可利用的方法。其中，为了避免雷帕霉素的全身副作用，通过局部给药的策略调节 OP-BMSCs 的自噬水平，恢复其衰退的细胞功能，促进其成骨分化和与界面骨整合，是一种潜在的替代方法。本论文在第二章部分设计了一种经皮超声介导的雷帕霉素递送策略，可以有效的激活 OP-BMSCs 自噬活性，改善成骨微环境，成功地促进了假体界面骨整合。但是，通过特制的超声电导仪频繁的经皮给药，可能导致患者依从性差，且增加了经济和时间负担，在做到个体化局部给药的同时也带来了诸多不便。因此，在本章节我们构建一种了由 3D 打印金属微孔假体和负载雷帕霉素的水凝胶构成的“3D 打印生物活性界面”作为一站式植入物，并成功地通过缓释雷帕霉111  \n\n素上调 OP-BMSCs 的自噬水平，并利于其在金属微孔表面的增殖和存活，激发其成骨分化潜能而抑制成脂分化，有望成为促进骨质疏松状态佳假体界面骨整合的新型植入物。  \n\n在动物体内骨整合研究中，我们首先观察了 3D 打印生物活性界面在体内的安全性，即在植入12 周后对主要内脏进行H&E 染色。钛合金材料被认为是骨科的理想材料，具有较好的生物相容性，已被广泛应用于临床。与微孔钛合金 pTi组相比，植入3D 打印生物活性界面后动物的心、肝、脾、肺和肾的微观形态结构并未发生改变，均与 pTi 组一样显示保持正常的组织学形态，表明 3D 打印生物活性界面在体内具有良好的安全性，这为新型假体界面的体内应用提供了初步的理论依据。  \n\n随后，我们在骨质疏松动物模型体内验证该 3D 打印生物活性界面的骨整合效果。Micro-CT 和组织学切片结果显示各组假体表面微孔中均有一定骨组织长入，表明3D 打印微孔假体这种与缺损高度匹配、具有互联多孔结构的植入物确能提供适当的初始稳定性和诱导骨长入。但是，在骨质疏松状态下，pTi 组和pTi@Gel 组未负载自噬激活剂——雷帕霉素，获得的骨长入以及力学结合强度明显不足，难以提供长期可靠的稳定性。我们在构建的 3D 打印生物活性界面中引入雷帕霉素，获得一个局部药物缓释的效果，通过激活 OP-BMSCs 自噬，调节成骨微环境，以期促进骨质疏松状态下的假体界面骨整合。随后，我们通过一系列检测，包括影像学、组织学和生物力学分析，可以直观地观察到假体界面上新生骨组织的长入，新生骨与假体界面结合牢固，显示了优越的骨整合效果。这些结果表明，3D 打印生物活性界面可以显著促进骨质疏松状态下的假体周围的骨形成和界面骨整合，从而减少假体植入后松动和移位等术后并发症的发生。此外，除了假体松动和移位，假体周围骨折也是假体植入后一个重要的术后并发症，通常与关节置换术后假体周围的骨量和骨质情况有关 [232, 233]。我们通过 Micro-CT评估和生物力学测试分析了假体界面周围的骨量和骨质，以及骨组织的抗折强度，以预测假体周围骨折发生的概率。结果显示，3D 打印生物活性界面植入后可以改善整个股骨远端的骨微观结构，增加局部的骨量，以及增加假体近端皮质骨的厚度和面积，同时显著提高假体周围骨组织的抗折强度，从而减少假体植入后假体周围骨折等术后并发症的发生。  \n\n为了进一步探究3D 打印生物活性界面植入后在局部促进骨再生与骨整合的机制，我们对假体界面骨组织中的自噬关键蛋白进行分析。结果显示 3D 打印生物活性界面植入后可以显著抑制 mTOR 蛋白的表达，（自噬体）膜型蛋白 LC3-II比例升高，自噬降解蛋白 P62 降低，表明局部微环境中自噬启动，且保持通畅，可有效清除代谢废物。这与既往研究结果相一致，即雷帕霉素可以通过抑制雷帕霉素敏感的 mTOR 靶点来激活细胞自噬 [234]。此外，雷帕霉素通过抑制 mTOR靶点激活干细胞自噬后，可通过激活 BMP/Smad 信号，诱导干细胞向成骨细胞分化 [234]。从而增加骨密度、骨体积百分比、骨小梁数量目和骨小梁厚度，可以有效减轻骨质疏松模型的骨丢失 [45, 196]。因此，在证明 3D 打印生物活性界面可激活 OP-BMSCs 自噬后，我们从基因和蛋白层面进一步观察界面周围的成骨微环境中成骨相关标志物 Runx-2、ALP、OCN 和 OPN 的表达。结果显示 3D 打印生物活性界面显著上调一系列成骨相关标志物的表达，极大地改善了假体界面周围的成骨微环境，促进细胞成骨分化、诱导骨长入，从而获得稳定的界面骨整合和改善界面周围骨微观结构，为减少假体置换术后松动、移位和假体周围骨折等并发症的发生提供基础。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 211,
        "chunk": "# 3.5.5 小结  \n\n3D 打印生物活性界面具有良好的生物安全性，可以通过局部缓释雷帕霉素有效的激活假体界面周围微环境中的自噬活性，改善成骨微环境，从而获得良好的界面骨整合和周围骨量、骨质提升，有效的减少假体置换术后松动、移位和假体周围骨折等并发症的发生。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 212,
        "chunk": "# 3.6 3D 打印生物活性界面促进感染状态下假体界面骨整合",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 213,
        "chunk": "# 3.6.1 实验仪器与材料",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 214,
        "chunk": "# 3.6.1.1 实验仪器  \n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>比利时Bruker 公司</td></tr><tr><td>硬组织切片机</td><td>德国Leica公司</td></tr></table></body></html>  \n\n续表：  \n\n\n<html><body><table><tr><td>冰冻切片机</td><td>德国Leica公司</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>日本Olympus 公司</td></tr><tr><td>万能力学测试机</td><td>日本Shimadzu公司</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>日本WC2公司</td></tr></table></body></html>\n\n其他仪器同 2.5.1.1。  \n\n3.6.1.2 主要试剂  \n\n\n<html><body><table><tr><td>试剂名称</td><td>厂家</td></tr><tr><td>碘伏毒液</td><td>山东利尔康医疗科技有限公司</td></tr><tr><td>兽用青霉素</td><td>华北制药集团有限责任公司</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>马松染料</td><td>美国Thermo 公司</td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>上海Aladdin生化科技有限公司</td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌（S.aureus）</td><td>ATCC</td></tr><tr><td>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)</td><td>ATCC</td></tr></table></body></html>\n\n其他试剂同 2.5.1.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 215,
        "chunk": "# 3.6.2 实验方法",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 216,
        "chunk": "# 3.6.2.1 骨质疏松兔股骨远端假体植入和组织获取  \n\n同章节 2.5.2.1，在骨质疏松兔左侧股骨远端外侧髁制备圆柱形骨缺损，500$\\upmu\\mathrm{l}$ 含有 $1\\times10^{5}$ CFU S. aureus 和 $1\\times10^{5}$ CFU MRSA 的菌液通过缺损注入骨髓腔内。随后，在缺损中分别植入 3D 打印微孔支架（pTi 组）、填充CEC-PVA-AgNW 水凝胶的3D 打印微孔支架（ $\\operatorname{\\dot{p}T i}(\\varnothing\\mathrm{Gel}$ 组）和填充负载雷帕霉素的 CEC-PVA-AgNW水凝胶的 3D 打印微孔支架（pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组）。植入术后用可吸收缝线闭合切口。动物实验共分为 3 个组，每组8 只，术后未使用抗生素。  \n\n植入后第 3 周和第 6 周，抽取静脉血进行白细胞计数，以评估全身感染。在处死前第 14 天和第 4 天肌肉注射钙黄绿素（ $\\mathrm{~(~8~mg/kg)~}$ ，以检测骨形成过程中的矿物质沉积率。术后第 6 周，过量麻醉法处死实验动物，收集左侧股骨样本，并将其固定在 $4\\%$ 多聚甲醛中，以进行后续的 Micro-CT、组织学检查和生物力学分析，具体操作步骤同章节 3.5.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 217,
        "chunk": "# 3.6.2.2 数据统计分析  \n\n同章节 2.1.2.3。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 218,
        "chunk": "# 3.6.3 结果",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 219,
        "chunk": "# 3.6.3.1 血液学检查评估全身感染状态  \n\n对于局部骨感染性模型，外周血白细胞（WBC）计数是反映全身感染严重程度的重要指标。如图 3.18 所示，在第0 周，即细菌（S. aureus 和MRSA）和假体界面植入术前的血液学检查表明各组之间的白细胞计数没有显著差异，计数指标处于生理范围内。然而，在植入后的第 3 周和第 6 周，pTi 组的白细胞计数随着时间的延长而持续增加，显著高于 pTi@Gel 组和pTi-Rap $@\\mathrm{Gel}$ 组（ $_{\\cdot\\mathrm{p}<0.01}\\cdot$ ）。这些结果表明，假体界面在局部释放的 AgNW 可以限制骨髓腔内的细菌增殖，并控制感染的全身扩散。  \n\n![](images/791f2e345611060513f7eade09f59904ebf719d7b544e7448ac8de651dd24416.jpg)  \n图3.18 外周血白细胞计数评估全身感染情况（ $**_{p}<0.01\\dot{.}$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 220,
        "chunk": "# 3.6.3.2 影像学评估假体界面骨整合效果  \n\n如图 3.19A 所示，X 线图像显示pTi 组植入物松动和移位，而 $\\mathsf{p T i}\\ @\\mathsf{G e l}$ 组和pTi-Rap@Gel 组固定在股骨远端外侧髁上，无明显松动迹象。假体界面的三维重建图像显示，pTi 组界面周围的骨再生受到明显限制。然而，在 pTi@Gel 组和pTi-Rap@Gel 组中可以观察到更多新生的骨组织在界面上和微孔内（图 3.19B）。Micro-CT 扫描后的骨形态学定量分析表明，相比于 pTi 组，pTi@Gel 和 pTi-  \n\nRap@Gel 组显示明显增加的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th），以及显著降低的骨小梁分离度（Tb.Sp）（图3.19C-F）。以上结果表明，感染性微环境中的骨形成受到明显阻碍，AgNW 抗菌水凝胶修饰的假体界面可以显著改善这种不利环境，从而促进骨再生。  \n\n![](images/ae3464b520332f6c7a0d4324534c708a8aa8286db1efb73b9c236ed1f4a754e5.jpg)  \n图3.19（A）左股骨远端 X 线正位片；（B）Micro-CT 3D 重建图像，白色为支架，黄色为骨组织；（C-F）Micro-CT 结果定量分析 BV/TV，Tb.N，Tb.Th，和 Tb.Sp参数（ $^{\\cdot}\\ast_{p}<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 221,
        "chunk": "# 3.6.3.3 组织学评估假体界面骨形成与整合效果  \n\n为了观察周围骨组织与假体界面的骨形成与整合效率，我们制备不脱钙硬组织切片，并在荧光显微镜下直接观察钙黄绿素荧光双标图像（图3.20A）。动态组织形态计量分析表明，与 pTi 组相比，pTi@Gel 和 pTi-Rap@Gel 组显著提高了骨缺损区域的新骨形成速率，如 MAR，MS/BS，BFR/BS 显著增加（图 3.20B-D）。随后将硬组织切片进行马松染色观察骨整合情况。如图 3.20E 所示，pTi 组中假体微孔内有大量黄色脓液，假体界面周围骨组织未见骨整合的迹象。然而，pTi@Gel 和 pTi-Rap@Gel 组的微孔支架内部及周边并无脓液聚集，且可见部分新生骨组织与假体界面接触、甚至长入微孔内部。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 222,
        "chunk": "# 3.6.3.4 力学评估假体界面骨整合效果  \n\n为了评估宿主骨和假体界面之间的结合强度，我们进行了支架推出试验。结果如图 3.20F 所示，pTi 组、pTi@Gel 组和 pTi-Rap@Gel 组的支架推出力峰值分别为 179.6±34.5 N、 $316.3{\\scriptstyle\\pm43.1}\\mathrm{N}$ 和 $345.4{\\scriptstyle\\pm44.6\\mathrm{N}}$ ，即与 pTi 组相比，pTi@Gel 组  \n\n和 pTi-Rap@Gel 组的支架推出峰值力显著增加了 1.76 倍和 1.92 倍（ $\\mathrm{p}{<}0.001\\rangle$ ）。  \n\n![](images/1736e8285a49f5a756e00090d4ad0f277b6746a6b1524eff7d97887ee62e8ff3.jpg)  \n图3.20（A）不脱钙硬组织切片观察钙黄绿素荧光双标；（B-D）通过钙黄绿素荧光双标对MAR、MS/BS 和BFR/BS 进行定量统计；（E）马松染色观察假体界面骨长入与整合（黑色区域表示假体，蓝色区域表示骨组织）；（F）植入 12 周后通过生物力学测试评估骨整合（ $^{*}p<0.05$ ; $^{**}p<0.01$ ; $^{***}p<0.001\\rangle$ ）。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 223,
        "chunk": "# 3.6.4 讨论  \n\n除了假体界面的骨整合不良导致的松动、移位和假体周围骨折等严重并发症，假体周围感染也是导致植入手术失败不可忽视的因素。临床回顾性分析显示人工髋关节置换术后发生假体周围感染的概率约为 $1\\%$ ，而膝关节置换术后感染率在$1-2\\%$ 之间 [249, 250]。也有报道表明初次人工关节置换术后的感染率可能比既往文献中报道的更高（ $(>2\\%)$ ）[251]。此外，术后假体周围感染是膝关节置换术后最常见的翻修原因（ $25.2\\%$ ），也占据髋关节翻修术的 $14.8\\%^{[252,253]}$ 。即使近年来由于无菌观念的提高，在膝关节翻修术中，假体周围关节感染（ $20.4\\%$ ）仍是仅次于无菌性松动（ $23.1\\%$ ）的第二大原因 [254]。大多数的早期感染可能源于假体的植入过程，主要包括内源性皮肤菌群和手术室来源的外源性菌群。针对假体周围感染的病例，除了实行翻修手术外，通常还需进行一个较长周期的抗生素治疗。但是在过去的几十年里，由于抗生素的广泛、不规范使用，细菌对抗生素产生的耐药性以及新型抗菌剂的研发缓慢成为假体周围感染治疗的一项挑战[255]。S. aureus是骨感染最常见的微生物 [256]。S. aureus 在化脓性骨髓炎中的检出率达到 $80\\%$ -$90\\%$ [257]。值得注意的是，MRSA 引起的骨感染比例增加 [258, 259]。对从假体周围感染中分离出的细菌分析显示，高达 $46.7\\%$ 的 S. aureus 对甲氧西林耐药，高达  \n\n$23\\%$ 的肠球菌对万古霉素耐药 [260]。分离获得的 MRSA 亚群显示对万古霉素敏感性降低 [252]。这些耐药生物的出现可导致患者关节置换术后假体周围感染的发病率和死亡率增加，因此，亟需研发具有新作用机制的新药来对抗这些感染对患者和医疗系统日益增加的负担 [261]。  \n\n纳米银是一种广谱抗菌剂，它通过多种机制对抗微生物，从而大大降低耐药性的机会。与离子银相比，纳米银具有更好的渗透和保留效果，因此被认为具有更优越的抗菌性能 [262]。银纳米粒子与体内的水分、血液或渗出液一旦接触即可被氧化，并释放出银离子。这些离子在局部微环境中可附着到细菌膜上，通过与细菌膜中的硫蛋白发生相互作用而损伤细菌膜, 随后进入细菌内破坏 DNA 结构。此外，还可通过攻击细菌的呼吸链，抑制细胞分裂，并最终导致细胞死亡。同时，银离子产生的自由基可诱导氧化应激，从而进一步加强杀菌能力 [262, 263]。银以其抗菌性能和低毒性而闻名，迄今为止，已在许多不同的产品中以离子和纳米颗粒的形式广泛使用，且已被证明对 E. Coil、S. aureus、肺炎克雷伯菌和 MRSA 等细菌有显著的抗菌效果 [264]。AgNW 除了以类似于银离子和银纳米颗粒的方式发挥其抗菌活性，与其他银纳米材料相比，由于它们的一维结构具有更高的长径比，使其具有不同的物理化学性质。与银纳米颗粒相比，AgNW 具有进一步增强含纳米银产品性能的潜力，因为它们似乎具有更高的抗菌效果和更低的细胞毒性 [264,265]。  \n\n假体周围感染严重影响宿主骨与假体界面的骨整合，甚至导致术后翻修。一般来说，具有抗菌活性的生物活性假体界面可以有效促进感染情况下假体界面周围的骨再生和骨整合。在本章节中，我们通过掺杂低浓度的 AgNW 赋予功能化水凝胶高效的抗菌性能，构建的 3D 打印生物活性界面可以有效减少假体周围感染的发生率，促进假体界面周围的骨形成与骨长入，提供合适的稳定性，进一步优化生物活性界面植入后的成功率。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 224,
        "chunk": "# 3.7 本章总结  \n\n本研究中，我们成功制备了由 3D 打印微孔钛合金假体和负载雷帕霉素的超分子多功能水凝胶组成的新型 3D 打印生物活性界面。该生物活性界面能够通过上调 OP-BMSCs 的自噬水平，从而恢复 OP-BMSCs 衰退的细胞活性，具体表现为促进其增殖、存活和成骨分化，抑制其成脂肪分化。此外 3D 打印生物活性界面具有良好的抗菌性能，对 S. aureus 和 MRSA 表现出优异的抗菌活性。在体内研究表明，3D 打印生物活性界面可显著改善骨质疏松微环境中假体界面的骨长入和骨整合，并抑制潜在的感染发生。总的来说，这种新型假体界面的设计，为自噬能力低下导致骨生成缺陷的患者提供了一种促进假体界面骨整合和预防术后假体周围感染的有效策略。",
        "category": " Conclusions"
    },
    {
        "id": 225,
        "chunk": "# 第 4 章 全文结论与展望",
        "category": " Conclusions"
    },
    {
        "id": 226,
        "chunk": "# 4.1 全文结论  \n\n在本研究中，我们通过 3D 打印技术成功构建了微孔钛合金假体，采用不同的局部雷帕霉素递送策略（即经皮超声介导的雷帕霉素递送和水凝胶负载雷帕霉素构建3D 打印生物活性假体界面），激活 OP-BMSCs 自噬活性， 以恢复其下降的细胞活性，如细胞增殖、存活和成骨分化，并且抑制其成脂分化，从而改善骨质疏松状态下假体界面的骨整合。以下是本研究的具体结论：  \n\n（1）以 $\\mathrm{Ti_{6}A l_{4}V}$ 粉末为原料，通过3D 打印技术成功制备了孔径为 $800\\upmu\\mathrm{m}$ ，孔隙率约为 $70\\%$ 的仿生微孔钛合金假体。此定制式假体具有互连的多孔结构、良好的生物相容性和合适的力学性能。  \n\n（2）成功提取骨质疏松兔 OP-BMSCs，并对其三向分化能力和细胞表型进行了鉴定。证实 OP-BMSCs 自噬活性低下，细胞增殖、存活和成骨分化能力不足且成脂肪分化增加；以不同的局部雷帕霉素递送策略为干预手段，可以改善OP-BMSCs 自噬水平，促进细胞增殖和存活，纠正成骨-成脂分化平衡。  \n\n（3）将3D 打印微孔钛合金假体植入骨质疏松兔股骨远端后，基于影像学、组织学和生物力学分析，证实经皮超声介导的雷帕霉素递送可通过激活自噬和调控成骨微环境，促进骨质疏松状态下假体界面骨整合。  \n\n（4）将 3D 打印微孔钛合金假体与负载雷帕霉素的功能化水凝胶复合成功构建了3D 打印生物活性界面，通过影像学、组织学和生物力学分析，证实功能化水凝胶介导的雷帕霉素局部递送可通过激活自噬、调控成骨微环境和预防潜在的假体周围感染，促进骨质疏松状态下假体界面骨整合。",
        "category": " Conclusions"
    },
    {
        "id": 227,
        "chunk": "# 4.2 本论文关键创新点  \n\n（1）根据骨质疏松微环境中 OP-BMSCs 自噬活性下降导致的细胞功能衰退为切入点，设计不同的药物递送策略以激活自噬、恢复细胞活性，促进微孔假体界面的骨整合。  \n\n（2）提出了一种 3D 打印微孔假体植入后，通过体外无创、个体化的经皮雷帕霉素递送策略，激活假体界面周围微环境中的自噬水平和调控成骨分化，从而促进界面骨整合的思路。  \n\n（3）构筑了一种 3D 打印微孔钛合金假体与负载雷帕霉素的功能化水凝胶复合的“3D 打印生物活性界面”，该无机-有机杂化界面激活自噬和调控成骨微环境，促进界面骨整合的同时还可预防潜在的假体周围感染，进一步提高假体植入的成功率。  \n\n（4）创新性的提出仿生 3D 打印假体结合不同雷帕霉素递送策略促进界面骨整合的理念，为提高骨质疏松等特殊骨质不良人群人工假体的研发提供新的思路。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 228,
        "chunk": "# 4.3 研究展望  \n\n虽然我们在通过不同的雷帕霉素递送策略在骨质疏松状态下促进3D 打印微孔假体界面骨整合中取得了显著性进展，但是从策略优化、分子机制及临床转化应用等方面仍然存在一些亟需解决的问题。基于以上问题，提出了本研究相关的不足与展望，以在后续研究中完善验证：  \n\n（1）考虑到雷帕霉素系统给药潜在的毒副作用，本研究的体内实验缺乏局部药物递送与全身给药的对比，未能充分确证局部药物递送在骨整合方面的低剂量、高效率的优势。  \n\n（2）对于局部雷帕霉素递送的药物释放节律和给药剂量有待进一步优化，以确定利于调节 OP-BMSCs 活性和促进界面骨整合的最优的药物释放策略和最佳的药物剂量。  \n\n（3）缺乏系统全面地揭示不同策略激活 OP-BMSCs 自噬和调控成骨微环境的深层分子生物学机制，后续研究中拟通过转录组学测序技术结合生物信息学分析，详细阐明内在机制，为提高骨质疏松等特殊骨质不良人群人工假体的研发提供更坚实的理论依据。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 229,
        "chunk": "# 参考文献  \n\n[1] Cross M, Smith E, Hoy D, et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study [J]. Ann Rheum Dis, 2014, 73(7): 1323-1330.   \n[2] 中华医学会骨科学分会关节外科学组等. 中国骨关节炎诊疗指南 2021 版 [J]. 中华骨科杂志，2021, 41 (18): 1291-1314.   \n[3] Liao Z, Zhang L, Lan W, et al. In situ titanium phosphate formation on a titanium implant as ultrahigh bonding with nano-hydroxyapatite coating for rapid osseointegration [J]. Biomater Sci, 2023,11:2230-2242.   \n[4] Tamimi I, Cortes A R G, Sanchez-Siles J-M, et al. Composition and characteristics of trabecular bone in osteoporosis and osteoarthritis [J]. Bone, 2020, 140: 115558.   \n[5] Chang C B, Kim T K, Kang Y G, et al. Prevalence of Osteoporosis in Female Patients with Advanced Knee Osteoarthritis Undergoing Total Knee Arthroplasty [J]. Journal of Korean Medical Science, 2014, 29(10): 1425-1431.   \n[6] Klemt C, Yeo I, Cohen-Levy W B, et al. 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