[
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        "id": 1,
        "chunk": "分  类  号： O631  \n研究生学号： 2020331140  \n\n单位代码：10183密   级： 公开",
        "category": " References"
    },
    {
        "id": 2,
        "chunk": "# 吉 林 大 学博士学位论文  \n\n多功能凝胶修饰碳纤维增强聚醚醚酮植入物的制备 及骨整合性能研究 Preparation and osseointegration investigation of multifunctional gel modified carbon fiber reinforced polyetheretherketone implants  \n\n作者姓名：董文英  \n专    业：高分子化学与物理  \n研究方向：高分子基生物医用复合材料  \n指导教师：姜振华 教授  \n培养单位：化学学院",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 3,
        "chunk": "# 多功能凝胶修饰碳纤维增强聚醚醚酮植入物的制备及骨整  \n\n合性能研究  \n\nPreparation and osseointegration investigation of multifunctional gel modified carbon fiber reinforced polyetheretherketone implants  \n\n作者姓名：董文英专业名称：高分子化学与物理指导教师： 姜振华 教授学位类别：理学博士  \n\n论文答辩日期： 2023 年  5 月 24 日授予学位日期： 年    月    日  \n\n答辩委员会组成：  \n\n姓名 职称 工作单位  \n主席 王献红 研究员 中科院长春应化所  \n委员 孙昭艳 研究员 中科院长春应化所吴广峰 教授 长春工业大学刘佰军 教授 吉林大学岳喜贵 教授 吉林大学",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 4,
        "chunk": "# 中文摘要",
        "category": " Abstract"
    },
    {
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        "chunk": "# 多功能凝胶修饰碳纤维增强聚醚醚酮植入物的制备及骨整合性能研究  \n\n骨组织是人体的重要组成部分，不仅起到固定身体结构的作用，而且由于骨骼的独特组成和复杂的结构使其具有保护、支持、运动、储存和造血等重要功能。在天然骨骼中，有机成分提供韧性，无机成分提供刚度。有机和无机成分的结合使骨组织表现出高强度和足够的韧性。骨骼的再生和恢复损伤组织的能力有限，对于超过临界尺寸的骨缺损则不能通过骨骼的再生能力自愈。为了改善损伤骨的重建能力，骨组织工程成为一种很有前途的治疗方法，逐渐替代自体骨移植和异体骨移植等传统治疗方法。在超过临界尺寸的骨缺损的愈合过程中，骨组织工程植入物需要协调不同愈合阶段（免疫、血管化和骨再生）以恢复缺损处的骨组织功能。目前，骨组织工程植入物主要包括金属材料、聚合物材料、陶瓷材料等。其中，聚合物材料是近年来的研究热点，特别是碳纤维增强聚醚醚酮（CFRPEEK）的深入研究对解决超过临界尺寸骨缺损的治疗具有显著的应用价值。CFRPEEK具有无毒、耐腐蚀、耐磨性、高强度、耐高温、高韧性、自然射线可透过性、与皮质骨相匹配的弹性模量、灭菌性能优异等优点。但是，CFRPEEK 的生物惰性和骨结合性差极大地限制了它的临床应用。因此，从骨缺损愈合所需要的生物功能的角度出发，结合临床对超过临界尺寸骨缺损植入物的需求，本论文通过磺化处理和紫外接枝等表面改性技术，将负载地塞米松的甲基丙烯酰化明胶-聚丙烯酰胺复合凝胶、氧化石墨烯-羟基磷灰石冷冻凝胶和金属有机框架水凝分别修饰CFRPEEK，从而开发了三种具有多功能生物活性凝胶修饰 CFRPEEK 骨科植入物，用于满足骨愈合环境下所需的多种生物功能，拓宽了 CFPEEK 复合材料在生物医学领域中的应用范围，为其临床应用提供了新的研发思路和科学参考。  \n\n1.从提升骨愈合所需的生物相容性和成骨能力的角度出发，设计制备了负载地塞米松（Dex）的复合凝胶修饰 CFRPEEK 植入物，用于治疗超过临界尺寸的骨缺损。采用磺化处理和紫外接枝的表面改性方法将负载地塞米松（Dex）的甲基丙烯酰化明胶/聚丙烯酰胺（GelMA/PAAM）修饰到 CFRPEEK 植入物的表面上，构建出了具有三维（3D）凝胶网络表面的 CFRPEEK 植入物。通过 SEM 图像观察到CFRPEEK 表面上的复合水凝胶网络结构，厚度为 $50\\upmu\\mathrm{m}$ ，水接触角为$48.8~\\pm~0.45^{\\circ}$ °，具有优异的亲水性。负载 Dex 的复合凝胶修饰 CFRPEEK 在21天内的 Dex 释放效率为 $53\\%$ ，缓慢持续的 Dex 释放能力有利于成骨分化。它在模拟体液中能够形成更多的骨状磷灰石结节，具有优异的体外矿化能力。体外细胞实验证实了 GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 具有良好的体外生物相容性和优异的体外成骨性能，其中，SCP/GP/Dex 上的BMSC 细胞增殖相较于 SCP 上的提高了 $42.11\\%$ ，ALP 活性提高了 $28.29\\%$ 。体内大鼠的颅骨缺损实验表明，GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 具有优异的体内成骨性能并且能够促进骨缺损的愈合。  \n\n2.从提升骨愈合所需的成血管和成骨能力的角度出发，设计制备了氧化石墨烯-羟基磷灰石（GO-HAP）冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 植入物，用于提高 CFRPEEK植入物的成血管和成骨能力。首先，采用原位键合法制备 GO-HAP 纳米复合材料。然后，采用磺化处理和基于自由基光聚合的冷冻凝胶方法将负载 GO-HAP 的冷冻凝胶接枝到CFRPEEK 植入物表面上，构建了具有 3D 海绵状大孔凝胶网络表面的 CFRPEEK 植入物。该冷冻凝胶层主要由氧化石墨烯-羟基磷灰石（GO-HAP）纳米复合材料和甲基丙烯酰化明胶/聚乙二醇二丙烯酸酯（GelMA/PEGDA）组成。体外成血管实验结果表明，在GH100 上形成的管的分支长度相较于 SCP 增长了 $111.18\\%$ ，血管网络结构最密集，这说明该多功能植入物表面的 3D 海绵状大孔结构和 GO 促进了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的长入和迁移，增强了CFRPEEK 植入物的体外成血管能力。良好的亲水性和 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的受控释放协同增强了CFRPEEK 植入物的增殖、粘附和成骨分化能力，其中BMSC 细胞在 GH100 上的增殖相较于 SCP 提高了 $24.41\\%$ ，ALP 活性提高了 $157.08\\%$ 。大鼠颅骨缺损实验进一步表明，GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰的 CFRPEEK 植入物可以迅速诱导体内的新骨和新血管的生成，显著提高了 CFRPEEK 植入物的成骨固定和骨重塑能力。  \n\n3.从进一步提升骨愈合所需的抗炎能力、成血管和成骨分化的角度出发，设计制备了 pH 响应性金属有机框架（MOF）凝胶修饰 CFRPEEK 植入物来增强CFRPEEK 在植入后的抗炎、成血管和成骨能力。首先，通过纳米羟基磷灰石（HAP）、没食子酸（GA）和镁离子（ $\\mathrm{Mg}^{2+}$ ）之间的配位和耦合作用设计制备了具有核壳结构的羟基磷灰石 $@$ 镁-没食子酸（HAP@Mg-GA）金属有机框架（MOF）纳米颗粒。然后，通过磺化处理和紫外接枝的方法将负载 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）凝胶接枝到 CFRPEEK 植入物表面。CSMA 不仅具有可光聚合性，还具有 pH 响应性，所以该凝胶基质可以随着骨缺损处生理环境 $\\mathsf{p H}$ 值的变化来控制 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒中 GA、 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 和$\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放，从而提高CFRPEEK 植入物的抗炎、血管化和成骨分化能力。体外抗炎和成血管实验结果表明，相较于 SCP，在 MGH 上促炎因子 TNF- $\\mathbf{\\nabla}\\cdot\\mathbf{a}$ 分泌减少了 $67.09\\%$ ，抗炎因子 IL-10 分泌增加了 $284.19\\%$ ，管的分支长度增长了 $81.82\\%$ 这说明负载在CSMA 水凝胶上的 $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA}$ 首先准确地释放抗炎药物GA 和微量元素 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 来应对炎症反应，为接下来的成骨分化创造良好的免疫微环境，同时， $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 还可以促进血管的原位生成。体内动物实验表明，MGH 周围的新生骨的骨小梁厚度相较于 SCP 提高了 $99.53\\%$ ，这说明在骨形成阶段， $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的持续长期释放有利于新骨的形成和植入物周围的骨稳态的恢复以及促进骨-植入物的整合。  \n\n综上所述，本论文通过多种表面改性方法，制备了一系列的多功能凝胶表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮植入物。对多功能凝胶修饰的碳纤维增强聚醚醚酮的表面性能表征、体外细胞反应和体内骨整合能力等均进行了探究，为进一步开发具有多功能生物活性表面的 CFRPEEK 骨科植入材料及其未来临床应用提供了科学参考及开发新思路。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 6,
        "chunk": "# 关键词：  \n\n碳纤维增强聚醚醚酮，凝胶，表面改性，多功能，骨整合",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 7,
        "chunk": "# Abstract",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 8,
        "chunk": "# Preparation and osseointegration investigation of multifunctional gel modified carbon fiber reinforced polyetheretherketone implants  \n\nBone tissue plays an important role in the life of a human. Bones serve crucial roles such protection, support, mobility, storage, and hematopoietic cell generation thanks to their distinctive composition and intricate structure. In natural bones, toughness is provided by organic components whereas stiffness is provided by inorganic components. Bone tissue has high strength and sufficient toughness due to the combination of organic and inorganic components. However, t bone has a limited capacity for tissue regeneration and recovery, especially for bone defects beyond critical size. Bone tissue engineering has emerged as a possible substitute for established treatment modalities like autograft and allograft in order to enhance the reconstruction of broken bones. In the process of healing a supercritical-size bone defect, bone tissue engineering implants need to coordinate different healing stages (immune regulation, vascularization, and bone regeneration) to restore bone tissue function at the defect. Currently, the primary materials used in bone tissue engineering implants are metal, polymer, ceramic, etc. The study of carbon fiber reinforced polyetheretherketone (CFRPEEK), which offers excellent practical potential for the treatment of supercritical-sized bone lesions, has received particular attention from researchers in recent years. CFRPEEK has the advantages of non-toxic, corrosion resistance, wear resistance, high strength, high temperature resistance, high toughness, natural ray transmittability, elastic modulus matching with cortical bone, excellent sterilization performance, etc. However, the bioinertness and poor bone binding of CFRPEEK greatly limit its clinical application. From the perspective of biological function required for bone defect healing, combined with clinical demand for bone defect implants with larger than critical size, this paper adopts surface modification technologies such as sulfonation treatment and ultraviolet grafting. Three multifunctional bioactive gel-modified CFRPEEK orthopedic implants were developed by modifying dexamethasone-loaded methylacrylyl gelatine-polyacrylamide composite hydrogel, graphene oxide-hydroxyapatite cryogel and metal-organic framework hydrogel, respectively, to meet a variety of biological functions required in the bone healing environment. The application range of CFPEEK composite material in the biomedical field is expanded, which provides a new research and development idea and scientific reference for its clinical application.  \n\nA dexamethasone (Dex)-loaded composite hydrogel modified CFRPEEK implant was designed and prepared for the treatment of supercritical-sized bone defects. Methacryloyl gelatin/polyacrylamide (GelMA/PAAM) loaded with dexamethasone (Dex) was modified onto the surface of the CFRPEEK implant by sulfonation treatment and ultraviolet grafting. The modified CFRPEEK had a 3D composite hydrogel network surface. The composite hydrogel network structure on the surface of CFRPEEK with a thickness of $50~{\\upmu\\mathrm{m}}$ was observed by SEM images. Its water contact angle is $48.8\\pm0.45^{\\circ}$ , showing excellent hydrophilicity. The Dex release efficiency of modified CFRPEEK was $53\\%$ within 21 days, and the slow and sustained Dex release ability was conducive to osteogenic differentiation. It formed more bone apatite in simulated body fluid and had excellent in vitro mineralization ability. In vitro cell results confirmed that GelMA/PAAM/Dex modified CFRPEEK demonstrated outstanding in vitro osteogenic performance and acceptable in vitro biocompatibility. The proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) on SCP/GP/Dex was increased by $42.11\\%$ and the activity of ALP was increased by $28.29\\%$ compared with that on SCP. In vivo experiments of rat cranial defects showed that GelMA/PAAM/Dex modified CFRPEEK had excellent in vivo osteogenic properties and could promote the healing of bone defects.  \n\nA graphene oxide-hydroxyapatite (GO-HAP) cryogel modified CFRPEEK implant was designed and prepared with the goal of enhancing the angiogenesis and osteogenesis processes necessary for bone healing. First, GO-HAP nanocomposites were prepared using in situ bonding method. Then, the cryogel loaded with GO-HAP was grafted onto the surface of the CFRPEEK implant by sulfonation, and the cryogelation technique based on free radical photopolymerization. The cryogel layer was mainly composed of GO-HAP nanocomposite and methacryloyl gelatin/polyethylene glycol diacrylate (GelMA/PEGDA). The results of in vitro angiogenesis experiments showed that the total branching length of the tube formed on GH100 increased by $111.18\\%$ compared with that of SCP, and the vascular network structure was the most dense, indicating that the 3D sponge-like macroporous structures on the surface of the multifunctional implant and GO promoted the growth and V  \n\nmigration of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The in vitro angiogenesis ability of modified CFRPEEK implants was enhanced. The excellent surface hydrophilicity and controlled release of $\\mathrm{Ca}^{2+}$ of modified CFRPEEK promoted proliferation, adhesion, and osteogenic differentiation of BMSCs. The proliferation of BMSCs on GH100 was increased by $24.41\\%$ compared with SCP, and the activity of ALP was increased by $157.08\\%$ . The rat cranial defect experiment further demonstrated that the GelMA/PEGDA/GO-HAP cryogel modified CFRPEEK implant could rapidly induce bone regeneration and new blood vessel formation in vivo and significantly improve the osteogenesis and bone remodeling ability of the CFRPEEK implant.  \n\nA pH-responsive metal-organic framework (MOF) hydrogel modified CFRPEEK implant was designed and prepared to enhance the anti-inflammatory, vascularization, and osteogenic properties of CFRPEEK after implantation. Firstly, hydroxyapatite $@$ magnesium-gallic acid (HAP@Mg-GA) metal-organic frame (MOF) nanoparticles with core-shell structure were prepared through coordination and coupling between HAP, gallic acid (GA) and magnesium ion $(\\mathrm{Mg}^{2+})$ . Methacryloyl chitosan (CSMA) hydrogel loaded with HAP $@$ Mg-GA MOF nanoparticles was then grafted onto the surface of the CFRPEEK implant by sulfonation and ultraviolet grafting. Methacryloyl chitosan was not only a photopolymer but also pH-responsive. Therefore, the hydrogel could control the release of GA, $\\mathrm{Mg}^{2+}$ , and $\\mathrm{Ca}^{2+}$ in HAP@Mg-GA MOF nanoparticles with the change of $\\mathsf{p H}$ of the physiological environment at the bone defect, so as to improve the anti-inflammatory, vascularization, and osteogenic differentiation abilities of the CFRPEEK implant. In vitro anti-inflammatory and angiogenesis experiments showed that, compared with SCP, the secretion of pro-inflammatory factor TNF- $\\mathbf{\\nabla}\\cdot\\mathtt{a}$ decreased by $67.09\\%$ , the secretion of anti-inflammatory factor IL-10 increased by $284.19\\%$ and the total branching length of the tube increased by $81.82\\%$ on MGH. In vitro cell experiments showed that HAP $@$ Mg-GA loaded on CSMA hydrogel first actively and accurately released anti-inflammatory drug GA and microelement $\\mathrm{Mg}^{2+}$ in response to inflammation in the inflammatory reaction stage, which created a good immune microenvironment for osteogenic differentiation in the following stage. Meanwhile, the released magnesium also promoted the formation of blood vessels in situ. The experiments of tibial defect in rabbits further showed the trabecular thickness of new bone around MGH was increased by $99.53\\%$ compared with SCP, indicating that the sustained long-term release of $\\mathrm{Ca}^{2+}$ facilitated new bone formation and restoration of bone homeostasis around the implant and promoted bone-implant VI  \n\nintegration.  \n\nA series of multifunctional gel surface modified CFRPEEK implants were prepared through a variety of surface modification methods in this work. The surface properties, in vitro cell reactions, and in vivo osteointegration of multifunctional gelmodified carbon fiber reinforced polyether ether ketone implants were investigated, which provided scientific reference and new development ideas for further development and future clinical application of multifunctional bioactive carbon fiber reinforced polyetheretherketone orthopedic implants.",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 9,
        "chunk": "# Keywords:  \n\nCarbon fiber reinforced polyetheretherketone, Gel, Surface modification, Multifunctional, Osteointegration",
        "category": " Abstract"
    },
    {
        "id": 10,
        "chunk": "# 目  录  \n\n第 1 章 绪论..  \n\n1.1 前言.  \n1.1.1 骨骼的构成与结构 .  \n1.1.2 骨缺损的修复过程 . 2  \n1.2 骨植入物材料 . .4  \n1.2.1 金属生物材料. 5  \n1.2.2 生物活性陶瓷 7  \n1.2.3 聚合物生物材料 .9  \n1.2.4 复合生物材料 .13  \n1.3 碳纤维增强聚醚醚酮 . .14  \n1.3.1 碳纤维增强聚醚醚酮的概述. ...14  \n1.3.2 聚醚醚酮及其复合材料表面生物功能化研究现状 ..15  \n1.4 水凝胶在骨组织工程中的应用研究 . .22  \n1.5 本论文设计思想 . .24  \n第 2 章 负载地塞米松的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备及其成骨  \n能力的研究 .. 27  \n2.1 前言. ..27  \n2.2 实验部分. ..29  \n2.2.1 实验材料与仪器 .29  \n2.2.2 磺化 CFRPEEK 复合材料的制备 ..31  \n2.2.3 甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的制备与表征. ..33  \n2.2.4 负载 Dex 的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备 .. ..33  \n2.2.5 力学性能测试 ..34  \n2.2.6 Dex 释放行为研究 . ..34  \n2.2.7 体外矿化行为研究 . ..35  \n2.2.8 细胞实验 ..35  \n2.2.9 大鼠颅骨缺损实验 . ..39  \n2.2.10 统计与分析 .. ..41  \n2.3 结果与讨论 ...41  \n2.3.1 甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的制备 ..41  \n2.3.2 负载 Dex 的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备 ... ...41  \n2.3.3 机械性能 . ...45  \n2.3.4 药物(Dex)缓释行为 .45  \n2.3.5 体外矿化性能 .46  \n\n2.3.6 体外 BMSC 细胞相容性.. .47  \n2.3.7 体外 BMSC 成骨分化潜能 ..48  \n2.3.8 体内骨整合性能 ..50  \n2.4 本章小结 .53  \n第 3 章 GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 的制备及其成血管/成骨  \n能力的研究 . ..55  \n3.1 前言 . ..55  \n3.2 实验部分 ...57  \n3.2.1 实验材料与仪器 .57  \n3.2.2 氧化石墨烯-羟基磷灰石(GO-HAP)纳米复合材料的制备与  \n表征 . .58  \n3.2.3 磺化 CFRPEEK 复合材料的制备 ..59  \n3.2.4 GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 的制备 .... .59  \n3.2.5 冷冻凝胶层的附着力测试 .. ...60  \n$3.2.6\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放行为 ... ..61  \n3.2.7 体外矿化行为研究 .. ...61  \n3.2.8 细胞实验 . ...61  \n3.2.9 大鼠颅骨缺损实验 . ...64  \n3.2.10 统计与分析 . ...65  \n3.3 结果与讨论 . ....65  \n3.3.1 氧化石墨烯-羟基磷灰石(GO-HAP)的制备 ...65  \n3.3.2 GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 的制备 . ....66  \n3.3.3 冷冻凝胶层的附着力 . ..70  \n$3.3.4\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放行为 ... ...70  \n3.3.5 体外矿化性能 ..71  \n3.3.6 体外 BMSC 细胞相容性. ...71  \n3.3.7 体外成骨性能 . ..74  \n3.3.8 体外成血管性能 .. ...76  \n3.3.9 体内成骨整合性能探究 . ..79  \n3.4 本章小结 .. .82  \n第 4 章 pH 响应性 MOF 水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备及其免疫/  \n成血管/成骨能力的研究 .. .83  \n4.1 前言 . ...83  \n4.2 实验部分 . ...85  \n4.2.1 实验材料与仪器 ....85  \n4.2.2 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的制备与表征 .. ....87  \n4.2.3 甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)的制备与表征 .. ...88  \n4.2.4 磺化 CFRPEEK 复合材料的制备 . .88  \n4.2.5 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的制备 . 88  \n4.2.6 水凝胶层的附着力测试 . ..89  \n4.2.7 表面 zeta 电势测试 ..89  \n4.2.8 蛋白吸附能力测试 . ..90  \n$4.2.9\\mathrm{Ca}^{2+}$ 、 $\\mathbf{M}\\mathbf{g}^{2+}$ 和 GA 在不同 pH 下的缓释行为测试 ....90  \n4.2.10 体外矿化行为研究. ..90  \n4.2.11 细胞实验 . ..90  \n4.2.12 体内动物实验 ..94  \n4.2.13 统计与分析 ..96  \n4.3 结果与讨论 ..96  \n4.3.1 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的制备 . ..96  \n4.3.2 甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)的制备 ..98  \n$4.3.3\\mathrm{MOF}$ 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的制备 ..98  \n$4.3.4\\:\\mathrm{MOF}$ 水凝胶层的附着力 ... .101  \n4.3.5 表面 zeta 电势 .. .101  \n4.3.6 蛋白吸附能力 . .102  \n$4.3.7\\mathrm{Ca}^{2+}$ 、 $\\mathbf{M}\\mathbf{g}^{2+}$ 和 GA 的在不同 pH 下的缓释行为 .103  \n4.3.8 体外矿化行为 .. .104  \n4.3.9 体外炎症反应 .104  \n4.3.10 体外成血管性能 .107  \n4.3.11 体外成骨性能 111  \n4.3.12 体内炎症反应和血管生成性能 . .114  \n4.3.13 体内成骨整合性能 .118  \n4.4 本章小结. .123  \n第5 章 结论与展望 .125  \n5.1 结论 . .125  \n5.2 展望 .127  \n129  \n\n参考文献 .",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 11,
        "chunk": "# 第1 章 绪论",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 12,
        "chunk": "# 1.1 前言  \n\n骨是一种坚硬的结缔组织，由基质、细胞和生物活性因子构成，具备层次结构[1]。骨骼也是一种具有自我更新能力的再生器官，为了保持其结构和功能而进行不断的重塑。在骨组织中，持续的重塑保持了骨的完整性[2]。临界尺寸骨缺损是指无法通过自身再生能力修复的最小骨缺损，或在生长周期内再生不足 $10\\%$ 的骨缺损。对于低于临界尺寸的骨缺损可以通过骨自身的重塑来愈合。骨重塑并不能修复由肿瘤、先天性疾病、感染性疾病以及车祸、创伤等意外因素引起的大型创伤和缺损[3]。目前，为了治愈临界或超临界骨缺损，临床实践中提出了多种骨缺损再生治疗方法，尤其是硬骨组织再生的治疗方法，包括异体骨移植、异种骨移植和自体骨移植等，但这些方法仍存在许多安全问题，如供体部位感染、供应有限、感染性疾病和免疫排斥等[4]。骨组织工程在近几十年作为一种很有前途的骨缺损治疗策略出现，研发人员开发了许多了生物活性材料作为骨移植替代品以恢复缺陷和患病的骨组织的功能[5]。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 13,
        "chunk": "# 1.1.1 骨骼的构成与结构  \n\n骨骼是骨骼系统的主要组成部分，还是人体复杂而协调的多部分“机器”的重要组成部分[6]。除了作为矿物库（如钙、磷酸盐和镁）和造血组织（如骨髓）的宿主外，骨骼还具有一系列的机械功能，它不仅负责保护内部器官（如大脑）和组织（如骨髓），也负责身体的支持和运动[7, 8]。骨骼是一种多层次结构的组织。在亚微结构水平上，骨骼主要由Ⅰ型胶原蛋白、矿物晶体、水和非胶原蛋白组成[9]。如Figure 1.1 所示，骨骼的有机和无机成分混合在一起形成矿化胶原纤维。骨骼中的矿物成分以薄的多晶片的形式分布在胶原纤维之间[10]，这种胶原-矿物系统平行排列在薄片中称为骨板。有机相和无机相的力学性能及其分层排列决定了骨的强度和韧性[11]。矿物质的含量主要有助于骨的硬度和强度[12, 13]。在宏观层面上，骨骼中有两种类型的骨组织：松质骨（也称为小梁或海绵状骨）和皮质（或致密）骨。每种类型的骨骼都以不同特定百分比的皮质骨和松质骨构成 [14]。皮质骨为骨髓间隙周围致密的外骨，而松质骨是由内骨小梁板和棒状体组成，在骨髓腔室中形成蜂窝状网络[15]，这两种骨组织的孔隙率和代谢水平也有所不同。松质骨是多孔的（孔隙率在 $40\\%$ 到 $90\\%$ 之间），密度比皮质骨小，这使得松质骨的结构更灵活、更脆弱，松质骨也比皮质骨有更强的代谢活性[16]。在微观层面上，皮质骨主要由骨单位构成，每个骨单位由 10-30 个骨板排列成同轴圆柱体并围绕着神经血管通道构成。松质骨主要由骨小梁构成，并散布在充满骨髓的空间中[17]。骨量是指单位体积内骨组织的质量，它由机体的机械应变维持并适应机体的日常活动[18]。机械转导过程是指骨细胞将外界机械力转化为生化反应，协调骨重塑的过程。机械转导过程是由骨骼中各种类型的细胞进行复杂的相互作用而完成的[19]。  \n\n![](images/711cd900faf6b95b49220985bf8a1ced62de285a8f22ce7a2e56af0cb57b2a48.jpg)  \nFigure 1.1 Bone hierarchical structure [20].",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 14,
        "chunk": "# 1.1.2 骨缺损的修复过程  \n\n骨骼系统结构和功能的完整性不仅能维持身体基本运动，还保护着脆弱的内脏器官。骨组织具有很强的维持内稳态的能力，并在骨吸收和再生的动态平衡中不断重建。骨组织一旦被病理性损伤，受损部分的各种细胞被激活并有序的参与愈合过程从而重建骨结构和功能[21]。由病理创伤引起的骨修复与自然的骨发育不完全相同一般包括三个阶段；炎症、修复和重塑阶段（Figure 1.2）,深入了解骨缺损的修复过程是设计骨组织工程支架的基础[22]。  \n\n炎症是骨缺损修复的起始，决定骨缺损愈合的结果[23]。当骨组织受伤时，骨缺损处的血管就会被破坏，血液进入骨缺损区，形成血肿。血肿中的纤维蛋白凝固形成一个临时基质，其中包含来自血液、骨组织和周围组织的成分。血肿的特征是局部缺氧、酸性、细胞变形和运动引起机械应力以及钙、磷和碱性磷酸酶的表达增加[24]。免疫细胞渗透到血肿处并通过分泌一系列的生物分子来触发炎症。具体来说，中性粒细胞在受伤 24 小时内被招募到骨损伤处吞噬细菌和碎片，分解受损伤组织并分泌促炎和趋化因子 [25]。促炎和趋化因子进一步招募单核/巨噬细胞和淋巴细胞，并分泌其他的生物因子，这些生物分子在骨缺损处进一步发挥作用[26, 27]。M1 巨噬细胞分泌的促炎因子（如 TNF- $\\mathbf{\\nabla}\\cdot\\mathbf{a}$ 、TGF- $\\cdot\\upbeta$ 和 $\\mathrm{IL}{-}1\\upbeta$ 等）可以进一步招募炎症细胞并吞噬坏死区域。M2 巨噬细胞分泌的促成骨因子（如 BMP-2）可以招募骨髓间充质干细胞（BMSCs）并调节其增殖、分化和促进骨的形成，同时，M2 巨噬细胞分泌的促血管生成因子（如 PDGF-BB 和 VEGF）可以招募内皮细胞参与新血管的形成和侵袭[28, 29]。  \n\n当炎症阶段完成时，缺损处的骨组织的代谢和修复逐渐增强[30]。在血肿内，纤维蛋白肉芽组织开始形成，BMSCs 从周围血管被招募到骨缺损区域。在各种生长因子/信号和缺氧环境的刺激下，BMSCs 分化为成纤维细胞、成软骨细胞和成骨细胞[23]。成纤维细胞增殖并分泌纤维基质，逐渐用纤维组织代替肉芽组织[31]。成软骨细胞/软骨细胞分泌半刚性无血管软骨基质，逐渐将富含纤维的肉芽组织转化为富含纤维软骨和透明软骨的软骨痂组织，这些软骨痂组织将骨缺损区域填充并提供临时的机械支持。在软骨细胞分泌基质并诱导矿化时，它们也会释放血管内皮生长因子（VEGF）以促进新血管的生长并与骨形态发生蛋白（BMP）协同合作增强骨愈合效果[32, 33]。在血管重建完成后，成熟的肥大软骨细胞发生凋亡或分化为成骨细胞样细胞并与成骨细胞参与细胞外基质矿化将软骨痂组织转化为硬骨痂组织[34]。硬骨痂组织外有血管化的基质修复骨膜，这一过程再现了胚胎骨发育过程中的膜内和软骨内骨化。在这个修复阶段之后，缺损区域可以恢复足够的机械性能来支持低强度的运动。为了进一步恢复正常的功能结构和机械强度，骨组织的修复进入了下一个阶段。  \n\n骨重塑是骨缺损修复的最后阶段。在这个阶段，骨痂的中心被致密的骨所取代，边缘被层状骨所取代，缺损处的血管网络恢复到骨缺损前水平，最终骨骼恢复到原始状态[35]。虽然骨修复过程可以使受损骨骼的细胞组成、结构和生物力学功能恢复到损伤前状态，但是对于大体积骨缺损不能正常愈合，这就需要合理的临床干预。骨组织工程植入材料的应用已成为解决这个问题很有前途的方法[30]。  \n\n![](images/4d9d7caa49f118de08ba159a78f83e356a4ee6d5664aa4a9a0727d6776c48853.jpg)  \nFigure 1.2 A complex and well-orchestrated bone repair process involving three phases; inflammation, repair, and remodelling phases [36].",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 15,
        "chunk": "# 1.2 骨植入物材料  \n\n骨组织工程（BTE）能够有效地避免自体骨移植和异体骨移植的缺点，在骨组织再生领域引起了广泛的关注。它旨在创造一种单独或联合使用生物材料、细胞和生长因子的生物功能组织，可以在体内整合和降解，以治疗病变或损伤的组织（Figure 1.3）。开发骨组织工程材料有多种临床原因，包括需要更好的“可用于重建大型骨科缺损的新型材料”，以及需要在机械上更适合其生物环境的骨科植入物。治疗大型骨缺损的骨移植替代品材料大致可分为金属、陶瓷，聚合物以及它们的复合材料[37-39]。  \n\n![](images/62008697cb5b2b1fb3963277cc06ef77fb1b304cbeec4b6ed1d4c11d509d4d12.jpg)  \nFigure 1.3 Bone tissue engineering strategies [40].",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 16,
        "chunk": "# 1.2.1 金属生物材料  \n\n金属生物材料由于其力学性能和可加工性优于生物陶瓷和生物聚合物材料，已被广泛应用于功能性和承重骨替代品[41]。大多数金属的力学性能远高于天然骨的力学性能，产生的应力不匹配使得骨与植入物接触的界面不稳定，导致纤维组织在植入物界面处向内生长，骨整合被破坏，植入物松动从而引起炎症反应，最终需要二次手术[42]。金属过高的力学性能可以通过增加其孔隙率来调整，增加金属生物材料的孔隙率不仅可以降低其力学性能，还可以提高其对细胞和营养物质的通透性，促进血管生成和骨长入[43]。目前，用作生物材料的主要金属合金是钛（Ti）合金，钴-铬（Co-Cr）合金和不锈钢，以及可生物降解镁（ $\\mathbf{Mg}^{\\mathrm{\\cdot}}$ ）合金。  \n\n钛（Ti）因其独特的医学适用性（如良好的生物相容性，高比强度，低重量和耐腐蚀性）而在骨科中广泛使用[44-46]。纯钛的较低的屈服强度值（小于 $480\\mathrm{MPa})$ ）和抗拉伸强度（小于 $550~\\mathrm{MPa})$ ），使其不足以作为承重骨植入物的材料，但是它的合金因有更好的机械性能成为承重骨植入物的首选材料[47]。与固体钛基植入物相比，多孔钛基植入物为骨的生长和沉积提供了更高的表面积，也为生物活性物质的添加提供了更多的选择[48, 49]。Li 等[50]通过电子束熔融法（EBM）制备了具有聚多巴胺-羟基磷灰石涂层的多孔 Ti6Al4V 支架。该支架增强了 MC3T3-E1细胞的体外增殖和成骨分化，在植入到兔股骨侧上髁后促进了植入物的骨整合和成骨分化能力（Figure 1.4）。  \n\n![](images/81f4b5221bf3c35c57fab1ccde836eb6e285a06229149d3af0b32d40e2f8192c.jpg)  \nFigure 1.4 HA/pDA-pTi morphologies and their biological functions prepared by electron beam melting [50].  \n\n与Ti 合金相比，钴（Co）-铬（Cr）合金具有良好的耐磨性和相对较高的强度[51]，其中钴增加了合金的强度，铬增强了合金的耐腐蚀性 [52]。由于良好的机械性能、可制造性以及对人体关节的生理环境的耐腐蚀性，Co-Cr 合金成为内源性假体和骨合成装置的首选材料[53]。Paolo 等[54]通过选择性激光熔化（SLM）技术制造的Co-Cr 多孔支架具有仿骨小梁的结构和机械性能，最大限度地减少骨科植入物的应力屏蔽，而且提高了 Co-Cr 合金的体外细胞活力和增殖性能以及体内的定植（Figure 1.5）。但是，Co-Cr 合金的摩擦腐蚀会造成Co、Ni 等离子的溶出对成骨细胞的毒性大，在体内引起细胞和组织的坏死[55]。  \n\n![](images/79acefc08e290b1e72cb96b7f6796911922320326c30aa844e82ed8783e5b75f.jpg)  \nFigure 1.5 Overview of the study workflow, showing graphical details of the modeling (left), manufacturing (central), and testing (right) subphases. The images report CoCr samples obtained via SLM and images from the topographical and biological evaluations [54].  \n\n由于易于制造，耐腐蚀性，良好的机械性能，以及相对较低的生产成本，医用不锈钢（MSS）是最常用的骨科植入材料之一，广泛应用于人体骨置换、牙科、心脏外科、冠状动脉支架置入等领域。不锈钢较差的生物相容性，使它不会自然地与骨骼结合，并且摩损会释放致畸、致癌作用的 Ni 等元素，这可能导致植入物失效。因此，提高不锈钢的耐腐蚀性是其作为骨科植入物放入关键。据报道，表面晶粒细化能够在不锈钢上制造表面层，从而有效地增强不锈钢的耐腐蚀性[56]。  \n\n镁（Mg）和镁合金作为一种可生物降解金属，因其低密度、优良的生物相容性、高生物可吸收性和适当的力学性能成为具有发展潜力的骨科植入物[57]。相对于天然骨，镁及其合金具有更高的强度，但它们的杨氏模量与皮质骨非常接近，这意味着它们可以减少种植体与骨界面之间的应力屏蔽[58]（Figure 1.6）。镁合金释放的镁离子不仅能促进干细胞分化成成骨细胞，还能促进成骨相关基因的表达[59, 60]。镁离子还能增强新骨组织的血管化，这对骨缺损处骨组织的恢复是至关重要的[57]。镁基金属在体液中过快的降解速率会释放过量镁离子导致局部毒性，还会使得植入物界面与周围骨组织形成空腔从而导致植入失败。因此，控制镁基金属在体液中的降解速率是其作为医用植入物临床应用的关键[61, 62]。目前，研究人员通过提高镁金属的纯度、合金化和表面改性来实现对镁基金属植入物降解速率的初步调控[63, 64]。例如，Hahn 等[65]在镁合金上通过喷涂技术制备了 HA 涂层以增强镁合金的生物相容性和耐腐蚀性。  \n\n![](images/5e8538d922ae7a641bb2e3382ae34edd28d5ec7d1805fb67ca21ac497ba28907.jpg)  \nFigure 1.6 (A) The distribution range of tensile yield strength of natural bone, commercially available orthopedic implants made of polymers and inert metals, and biodegradable $\\mathbf{Mg}$ and its alloys; (B) The peak stress distribution in a finite element analysis (FEA) model composed of a femur and an inserted titanium (Ti) or Mg-based screw [58].",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 17,
        "chunk": "# 1.2.2 生物活性陶瓷  \n\n生物活性陶瓷是指一类具有特定生物或生理功能的陶瓷材料。它们在植入后能够直接与骨组织结合，所以被广泛应用于骨组织工程领域[66]。目前广泛使用的生物活性陶瓷包括磷酸钙（CaP）、生物活性玻璃（BG）和硅酸钙（CS）[67-69]，这些生物活性陶瓷在组成与结构上与骨的矿物相相似并且能够在体内自降解。这些生物陶瓷在组织工程领域的有效应用必须考虑它的生物吸收的程度和较差的机械强度[70-71]。目前，研究人员对生物活性陶瓷的化学成分、生物活性、制备工艺及其改性等之间的关系进行了大量的研究来提高它们的临床应用潜力。  \n\n磷酸钙（CaP）是骨组织工程中最常用的生物活性陶瓷。目前，最常用的磷酸钙基生物陶瓷包括磷酸三钙（TCP）和羟基磷灰石（HAP）。基于 HAP 植入物在植入后可与周围组织形成化学键，以促进新骨的生成 [72]。TCP 具有优良的生物活性、生物降解性和生物相容性，可以提高干细胞增殖能力并诱导骨再生[73]。不论是致密的 HAP 陶瓷还是通过 3D 打印技术制作的抗压的 TCP 支架的力学性能都远低于承重骨。因此，为了解决这些材料力学性能差的问题，研究人员通常采用与聚合物复合制备复合材料的方法来提高它们的强度和韧性。例如，Davila等[74]通过3D 迷你螺杆挤出打印制造PCL/ $\\mathrm{^{\\prime}\\beta}$ -TCP 支架。该支架的孔隙率为 $55\\%$ ，孔径为 $450~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ，表现出良好的机械性能和亲水行为（Figure 1.7）。  \n\n![](images/9a4ed955214bc422f3c0870fc1b3ff128f34392db454e3ed7029b7ff1f47f48f.jpg)  \nFigure 1.7 SEM micrographs of scaffolds: (a) P100C0, (b) P90C10, (c) P80C20, and (d) P70C30. (At row 1 is presented the $0^{\\circ}/90^{\\circ}$ architecture, at row 2 the strand surface and at row 3 the cross section of the strand) [74].  \n\n生物活性玻璃（BG）作为一种骨修复材料，可以促进骨钙素基因的表达[75]。该材料的典型特征是与活组织相互作用的能力强，特别是能与周围的骨组织牢固结合[76]。生物活性玻璃的这种骨结合特性是由于其表面的离子的浸出与交换以及玻璃网络的溶解，这促进骨样磷灰石的沉淀和生长[77]。生物活性玻璃还能吸引相关（骨）细胞的粘附、增殖和分化。最近的研究证明，生物活性玻璃的离子溶解和释放能够激活骨生成细胞的基因表达，从而增强骨再生[78]。Wang 等[79]通过3D 打印技术制备了聚己内酯/生物活性玻璃支架，含有生物活性玻璃的支架具有更高的亲水性和更高的抗压强度，并且 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ , $\\mathbf{P}^{5+}$ 和 ${\\mathrm{Si}}^{4+}$ 的释放促进细胞的成骨分化和体内的骨再生（Figure 1.8）。  \n\n![](images/c0841e64753280fa1684a8989288dae80a6be9b0c11ee502d9a4159abda9659f.jpg)  \nFigure 1.8 (a) Micro-CT and X-ray radiographs images. (b) Histological analysis of bone regeneration in tibial defects by scaffolds with different ratios (5, 10 and 20 $w t\\%$ ) bioactive glass at 8 weeks after surgery[79].  \n\n硅酸钙（CS）因其优异的生物活性而引起人们的广泛关注。目前，硅酸钙（CS）基生物陶瓷的生物医用范围包括修复硬组织裂纹、作为骨支架、骨水泥或植入物涂层[80]。硅酸钙（CS）基生物陶瓷具有良好的生物活性和与活骨和软组织结合的能力。特别是，硅离子能够在模拟体液（SBF）中诱导骨样磷灰石的形成[73]（Figure 1.9）。为了利用硅酸钙（CS）基生物陶瓷离子释放的有益作用，并提高它在特定宿主响应方向上的生物性能，科研人员通过各种制造技术和不同的生物分子的添加使其尽可能接近骨组织再生的力学和生物特性。  \n\n![](images/a10eff705cdee052a7dd49164af9e0cef286bbed6c6f63d4c171131d8fdc8c6c.jpg)  \nFigure 1.9 Schematic illustration of the mechanism of apatite formation on calcium silicate ceramics in SBF [80].",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 18,
        "chunk": "# 1.2.3 聚合物生物材料  \n\n聚合物生物材料因其灵活的可设计性、广泛的可用性、低毒性/无毒、生物降解性、生物相容性、化学多功能性和固有的功能而在骨组织工程材料开发中受到了广泛的关注[81]。聚合物生物材料可分为天然聚合物材料和合成聚合物材料[82-88]。  \n\n天然聚合物是由多个单体或化合物单体连接在一起形成的长链。天然聚合物是组织本身的组成部分，具有优异的生物相容性和生物降解性，可以提高细胞粘附，促进细胞趋化反应，从而增强支架与组织之间的生物相互作用[89]。如图Figure  \n\n1.10 所示，最常用的天然聚合物包括壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、明胶、透明质酸和纤维素等 [90]。明胶是通过酸水解或碱水解胶原蛋白获得的一种天然蛋白质[91]。明胶广泛存在于哺乳动物中，具有良好的生物相容性，如促进细胞粘附、细胞增殖和细胞分化[92]。它还含有丰富的精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸（RGD）序列，参与细胞信号传导[93]。在骨组织工程中，明胶及其衍生物已被用作骨修复的支架。例如，Liu 等[94]通过 3D 打印技术制备了负载细胞的纳米凹凸棒石/甲基丙烯酰化明胶（cell-laden nano-ATP/GelMA）复合水凝胶支架用于骨组织修复（Figure 1.11）。该支架可有效改善骨再生，促进血管生成。  \n\n![](images/b88faf3cc6f27484fcc6dcf99d384bc1ca37daef618e14ee38315d2b07d48aeb.jpg)  \nFigure 1.10 various types of natural polymers have been used in bone tissue engineering [90].  \n\n![](images/bb6ecb3d87d9205b24e582c95e59bfe68ce4d0f2f2c7b34f73c0542288501ef2.jpg)  \nFigure 1.11 Schematic illustration of the preparation and characterization of cellladen nano-ATP/GelMA composite hydrogel scaffolds [94].  \n\n在天然聚合物中，壳聚糖是另一种可用于骨再生和修复的聚合物。壳聚糖是一种由甲壳素脱乙酰化而得的线性带正电荷多糖，是虾、蟹等甲壳类动物外骨骼的主要成分 [95, 96]。壳聚糖在体内酶的作用下降解为 N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，对人体无毒，可被机体充分吸收[97, 90]。壳聚糖的特点是具有更好的细胞相容性、生物降解性、无毒性和黏液粘附性。它还对骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有良好的亲和力和成骨诱导能力，在骨再生中具有广阔的应用前景[98-103]。壳聚糖较差的机械强度妨碍了它的应用，所以需要它与不同的材料（磷酸钙、羟基磷灰石等）结合来提高机械性能。例如，Tuğrul 等[104]将壳聚糖/羟基磷灰石复合水凝胶与MC3T3-E1 细胞混均，并作为 3D 打印的生物墨水。研究分析表明，通过3D 打印制备的新型支架在生理条件下能够保持粘弹性和稳定性，并且在支架中的MC3T3-E1 细胞具有优异的细胞活力和成骨相关基因的高水平表达（Figure1.12）。  \n\n![](images/30dcd7a2e260fdb33e1d4087b90fbc5c8f25b3a86051d08745274fc42f74a9dd.jpg)  \nFigure 1.12 Live/Dead assay and viability of MC3T3-E1 cells encapsulated in hydrogel discs [104].  \n\n与天然聚合物相比，合成聚合物可以避免在人体内引发免疫反应，并且可以通过适当设计聚合物官能团来呈现定制的结构，以满足生物材料所需的功能。这些优势保证了合成聚合物可预测、可重复和可调的特性，可以根据具体应用而变化。目前，研究最多的合成聚合物包括：聚乳酸（PLA/PLLA）、聚己内酯（PCL）、聚乳酸-乙醇酸（PLGA）、聚醚醚酮（PEEK）和聚乙二醇（PEG）等[81, 89, 105-107]。聚乳酸（PLA/PLLA）具有低成本、生物相容性和生物降解性等优点[108]，但它在降解过程中会产生乳酸副产物。在降解的早期阶段，乳酸可以自行代谢；在降解后期，过多的乳酸副产物可形成局部酸性环境，导致组织炎症和细胞死亡[109, 110]。PLA 适用于制备复合材料以增强支架的生物活性并达到良好的治疗效果。例如，Holmes 等[111]通过 3D 生物打印技术制备的 PLA/羟基磷灰石支架具有良好的机械性能，并与骨骼的抗压强度相似，体外人间充质细胞实验也表明它的细胞粘附、增殖和骨分化能力更强，这使其适用于骨组织工程（Figure 1.13）。  \n\n![](images/69519dd40320ffa280c58525977877026700487ceff2faf3dba4e5756316fe98.jpg)  \nFigure 1.13 Flow chart showing the overall experimental design [111].  \n\n聚醚醚酮（PEEK）是一种半结晶型热塑性芳香族聚合物[112, 113]。如 Figure1.14 所示，PEEK 具有耐高温、耐化学性、耐磨性、耐疲劳性、机械强度高、易于加工、自然射线可透过性和与正常人骨相似弹性模量等特性，使其成为具有广阔应用前途的骨科植入物材料之一[114-117]。为了将PEEK 作为承重植入材料，如口腔种植体，研究人员使用了羟基磷灰石（HA）、碳纤维（CF）和玻璃纤维（GF）等填料来增强PEEK 基质材料，以提高其力学性能[118-120]。聚醚醚酮的生物惰性限制了其在骨修复领域的应用。因此，研究人员对聚醚醚酮材料的进行了改性研究，旨在提高其生物活性和骨结合性能，以期拓宽聚醚醚酮的临床应用范围[121]。  \n\n![](images/0e4a0270f9cec809d41f799e6861fba92432dcb96d93ac19a1edcc277f38f551.jpg)  \nFigure 1.14 Schematics of the mechanical, chemical, biological and other properties of PEEK and its composites [122].",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 19,
        "chunk": "# 1.2.4 复合生物材料  \n\n复合生物材料旨在结合两种或多种材料来提高支架的加工性能、印刷性能、机械性能和生物活性，以获得理想的骨植入物。复合植入物按其连续相成分可分为金属基、陶瓷基和聚合物基[123]。金属基复合植入物具有优异的力学性能、生物相容性、热稳定性和耐腐蚀性，在临床医疗中得到了广泛的应用。Ti6Al4V 是具有代表性的金属基复合材料。具有合适孔径的多孔 Ti6Al4V 支架的杨氏模量可与天然骨相似，从而减少了应力屏蔽导致的骨质疏松[124, 125]。Ti6Al4V 支架通过包覆钽涂层[126]，加入含有辛伐他汀的水凝胶[127]，或包覆羟基磷灰石/聚多巴胺涂层 [128]，显著促进Ti6Al4V 支架的骨长入、骨整合和成骨能力。尽管金属基复合植入物表现出许多优点，但金属基复合植入物的非生物降解性妨碍了其成为理想植入物。目前，聚合物基复合材料和陶瓷基复合材料在骨组织工程上的应用获得了很大的进展。聚合物材料具有多种适用于骨组织工程的性能，如可生物降解性和可调节的机械性能[129-133]。陶瓷材料在植入后能够直接与骨组织结合 [134]。由陶瓷和聚合物制备的复合材料具有成为骨组织工程植入物的理想性能[135, 136]。例如，Zhao 等[137]将铌掺杂生物活性玻璃（NbBG）分散在具有自溶胀特性的双交联明胶-透明质酸水凝胶（GH）网络中制备了 GH-NbBG 水凝胶（Figure 1.15）。NbBG 的加入显著改善了水凝胶的力学性能，GH-NbBG 水凝胶促进血管生成，  \n\n并通过自身溶胀增加更多的骨的长入。  \n\n![](images/cf5cece71c804e31c12619f12a120fd8977243bbc1cd3baf2c9fedf994ffa7a6.jpg)  \nFigure 1.15 Preparation and biological function diagram of GH-NbBG hydrogel [137].",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 20,
        "chunk": "# 1.3 碳纤维增强聚醚醚酮",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 21,
        "chunk": "# 1.3.1 碳纤维增强聚醚醚酮的概述  \n\n碳纤维增强聚醚醚酮（CFRPEEK）复合材料能够提供承重骨所需的刚度、韧性和耐磨性[138]。CFRPEEK 保留了 PEEK 的优势特性，例如：（1）优异的化学稳定性，常温下能够耐受浓硫酸外的所有化学试剂；（2）自然射线可透过性，这一特性有助于对植入物进行放射影像学探究；（3）易于加工性，CFRPEEK 可以通过多种加工方法制备[114-117, 139]。CFRPEEK 具有承重应用所需的机械性能，如作为关节置换和断裂稳定板，并且在植入后能适应机体的磨损和高应力[140, 141]。  \n\nCFRPEEK 可以通过改变碳纤维的体积分数、方向和长度精确的控制  \n\nCFRPEEK 的弹性模量以精确匹配骨的模量（18-20 GPa）[142]，从而避免在金属植入物中经常出现的应力屏蔽现象，这使 CFRPEEK 成为许多骨科植入物的合适选择。CFRPEEK 具有非常高的韧性和刚度，特别是其优异的抗疲劳性，堪比金属材料 [143]。CFRPEEK 还具有优异的自润滑和耐磨性能，CFRPEEK 的磨损量是超高分子量聚乙烯（UHMWPE）的一半，这些性能有助于 CFRPEEK 成为骨科植入物 [144-145]。CFRPEEK 的耐腐蚀性使其不会像金属植入物一样被体液腐蚀，从而释放出有毒的金属离子，最终引起毒性效应。  \n\nCFRPEEK 优异的理化性能使其非常适合在骨科中应用，但其表面具有生物惰性，严重限制了其临床应用[146]。由于植入后的体内排异反应， CFRPEEK 植入物不会直接锚定在周围的骨骼上，而是倾向于被纤维组织包裹或被细菌感染[147-150]，这种现象使得 CFRPEEK 植入物在体内不稳定并且会发生迁移导致植入失败[151]。CFRPEEK 表面极易被细菌粘附，这增加了植入物周围组织感染的风险[152, 153]，这些不太理想的植入情况会使得 CFRPEEK 表面形成炎性纤维囊而不是形成新骨[154]。所以，CFRPEEK 的表面需要进一步进行处理来增强它的生物活性。",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 22,
        "chunk": "# 1.3.2 聚醚醚酮及其复合材料表面生物功能化研究现状  \n\n为了改善聚醚醚酮及其复合材料的骨整合能力，目前广泛研究的改性策略有两种：（1）研发含有羟基磷灰石或生物活性玻璃等活性材料的复合材料；（2）通过表面改性策略来提高植入物的骨结合性能[145]。虽然复合材料可以改善骨整合能力，但在聚醚醚酮及其复合材料中掺入脆性材料（如HA）会降低聚醚醚酮及其复合材料的机械性能，这可能会缩短植入物的使用寿命[112]。表面改性策略致力于采用多种物理化学方法在聚醚醚酮及其复合材料表面上构建生物活性结构或引入生物活性物质，以提高材料表面的生物相容性和成骨能力。表面改性策略作用于聚醚醚酮及其复合材料表面，不会改变聚醚醚酮及其复合材料的机械性能[155, 156]。表面改性策略可分为直接表面改性和表面涂层沉积。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 23,
        "chunk": "# （1）直接表面改性  \n\n表面等离子体处理技术、加速中性原子束技术和激光技术等高能粒子处理方法以及表面化学处理等表面处理方法都可用于聚醚醚酮的表面处理。  \n\n$\\textcircled{1}$ 等离子体  \n\n等离子体处理是指利用 $\\mathrm{N}_{2}$ 、 NH3、 O2、 Ar 和 H2 等气体等离子体对聚醚醚酮及其复合材料植入物表面进行处理，改变其表面形态或在其表面构建具有生物活性的官能团结构[157-160]，从而提高聚醚醚酮及其复合材料的表面亲水性、生物活性和生物相容性[161-163]。  \n\n等离子体浸没离子注入（PIII）是另一种等离子体处理方法，可在聚醚醚酮及其复合材料表面上引入金属元素或官能团，而不受传统等离子体处理的限制[164]。例如，Zhao 等[163]通过水（ $:{\\mathrm{H}}_{2}{\\mathrm{O}}\\ \\cdot$ ） 和氨（NH3）等离子体浸没离子注入（PIII）技术改变了PEEK 表面的亲水性和表面粗糙度，显著增强了 PEEK 的体外成骨分化和体内的骨整合能力（Figure 1.16）。等离子体处理的方法可重复、便宜且易于操作，可应用于各种形状和结构材料的改性。但是，等离子体处理产生的修饰效果无法长期维持，修饰后的材料表面只能维持短期的生物活性。  \n\n![](images/b6e93bdc850a7c96d730357990e572759851c7a65fc0728b4566673370023222.jpg)  \nFigure 1.16 Diagram of preparation and biological function of PEEK modified by plasma immersion ion implantation (PIII) [163].  \n\n$\\textcircled{2}$ 加速中性原子束  \n\n加速中性原子束（ANAB）技术采用中性气体原子的强定向束来修饰聚醚醚酮及其复合材料。该方法可以控制每个原子的平均能量为 10eV 到 $100\\mathrm{eV}$ 的范围内，ANAB 对材料表面的改性深度仅为 2-3 纳米，是一种超浅表面处理技术，对基体结构的影响远远小于其它改性方法[165-167]。目前，Khoury 等证实了ANAB 技术可以通过改变 CFRPEEK 表面形貌和增加粗糙度来增强聚醚醚酮及其复合材料生物活性，有利于聚醚醚酮及其复合材料与周围组织和骨骼的结合 [165, 168, 169]。  \n\n$\\textcircled{3}$ 激光  \n\n激光技术是利用激光辐照改变材料表面形貌和化学性质。在这种方法中，激光束直接发射到聚醚醚酮及其复合材料表面上，激光提供的光能被材料表面吸收，温度升高使得表面熔化或汽化，从而导致材料表面粗糙度的改变[170]。相关研究表明，粗糙的表面能够促进细胞的粘附和增殖[171, 172]。这种方法具有成本低、分辨率高、操作速度快等优点。激光技术不改变植入体的形状，只处理材料的表面[173]。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 24,
        "chunk": "# $\\textcircled{4}$ 紫外线  \n\n紫外线的辐照可以破坏聚醚醚酮主链结构中的酮羰基，产生自由基，诱导生物活性烯烃或其他活性单体聚合，从而使生物活性物质接枝到聚醚醚酮及其复合材料表面[174, 175]。紫外线（UV）辐照接枝对设备的要求比较低，操作相对简单，不影响材料的结构和性能。例如，Pang 等[176]通过紫外诱导丙烯酸（AAc）接枝聚合将羧基引入PEEK 表面，再通过 AAc 的羧基与壳聚糖（CS）的氨基反应将CS固定在PEEK表面，从而提高了PEEK表面的亲水性和抗菌性能（Figure 1.17）。  \n\n![](images/60cc78a9d3d02439046821f8a3a3cb7aca8b06a8a79b4d2a2fbf6078984efc71.jpg)  \nFigure 1.17 Immobilization of chitosan on polyether ether ketone surface modified with acrylic acid by UV-induced graft polymerization [176].  \n\n$\\textcircled{5}$ 磺化处理  \n\n磺化处理是通过浓硫酸处理，在聚醚醚酮及其复合材料表面形成三维、多孔、纳米结构网络，引入磺酸基团，以增强聚醚醚酮及其复合材料生物活性的改性方法。通过磺化处理获得的孔径范围为 $0.5{\\sim}1.0{\\upmu}\\mathrm{m}$ 。磺化处理促进了成骨细胞在PEEK 上的粘附、增殖、分化、骨再生和磷灰石形成[177-180]。残留的硫会对成骨细胞的行为和新骨的形成产生影响[177, 181]。适当的后处理方法，如水热处理[182]、丙酮洗涤[183]和氢氧化钠冲洗[184]，有助于去除多余的硫。例如，Ma 等[185]比较了不同后处理方法（丙酮冲洗，水热处理，和氢氧化钠浸没）处理磺化 PEEK，发现不同后处理方法对去除残留硫酸和细胞相容性表现出相同的效果，并且没有改变 PEEK 表面形貌（Figure 1.18）。  \n\n![](images/a675fb671be70ab581aebc00ca5ba0da4301ee5b489bf596f43607a0119adf41.jpg)  \nFigure 1.18 (a) Schematic diagram of optimization of the sulfonation time and post-treatment method of sulfonated PEEK. (b) Cell viability of MC3T3-E1 cells on the surface of SPEEKs with different post-treatment methods, (T1: acetone rinsing,  \n\nT2: hydrothermal treatment, T3: NaOH immersion) [185].  \n\n$\\textcircled{6}$ 其它化学处理方法  \n\n除了磺化处理外，科研工作者还利用多种化学物质来还原或水解聚醚醚酮及其复合材料表面，从而在聚醚醚酮及其复合材料表面引入氨基、羧基等活性基团[186, 187]。对于PEEK 的表面羧基化，首先通过硼氢化钠（ $\\mathrm{NaBH_{4}}$ ）将其表面的羰基还原为羟基，接下来羟基化预处理的 PEEK 用有机硅烷溶液处理，从而形成羧基（-COOH）化的功能性表层，最后PEEK表面的羧基与肽的氨基之间形成-CONH，从而实现了生物活性分子的固定[188]。  \n\n（2）表面涂层沉积  \n\n表面涂层沉积是将能与骨结合或促进骨生长的材料沉积在聚醚醚酮及其复合材料表面以改善它们的骨整合性能。用于表面涂层沉积的材料包括： $\\textcircled{1}$ 生物活性离子； $\\textcircled{2}$ HA、Ti 和二氧化钛（TiO）等骨传导材料； $\\textcircled{3}$ 蛋白质、多肽和/或药物[145]。  \n\n$\\textcircled{1}$ 生物活性离子  \n\n目前已知的能够促进成骨的生物活性离子，包括：钙（Ca）、镁（ $(\\mathbf{Mg})$ ）和锌（Zn）等。将这些生物活性离子直接作为涂层或者间接用作生物玻璃基涂层的掺杂剂来增强PEEK 及其复合材料的表面粗糙度，从而达到提高 PEEK 及其复合材料成骨性能的目的[189-192]。  \n\n钙（Ca）是骨的主要成分之一， $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 调节成骨细胞的分化以及胶原蛋白和骨蛋白的表达[193]。Lu 等[193]通过钙等离子体浸没离子注入（Ca-PIII）技术将纯钙涂层沉积到 PEEK 表面（Figure 1.19）。大鼠骨髓间充质干细胞 （BMSC） 在 Ca-PIII 处理的PEEK 表面上的粘附、增殖和骨分化得到改善。  \n\n![](images/a7001dd4e74eaec0e3b0c7b8e3f3fce9eb74248521a59b412ad70309dbc38e60.jpg)  \nFigure 1.19 A schematic illustration of calcium plasma immersion ion implantation (Ca-PIII) modified PEEK [193].  \n\n镁 $(\\mathbf{Mg})$ ）参与了许多细胞过程，如 $\\mathrm{Na^{1+}}$ 和 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 离子通道的调节、细胞附着、生长和增殖，以及骨代谢和结晶[194]。例如，Ren 等[195]通过微波辅助工艺在PEEK上制备了具有生物活性的无定形磷酸镁（AMP）涂层。无定形磷酸镁（AMP）涂层作为 PEEK 植入物和宿主组织之间的生物活性界面，通过释放 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 促进了MC3T3-E1 细胞在PEEK 上的增殖和成骨分化，改善了 PEEK 的骨整合性能。  \n\n锌（Zn）为一些参与骨形成过程的蛋白质提供结构支持，并通过促进细胞增殖和成骨基因的表达来调节成骨细胞的代谢[196]。Lu 等[197]采用锌和氧等离子体双重浸没离子注入来修饰 CFRPEEK 表面，同时实现了锌的掺入以及独特的微/纳米结构的形成（Figure 1.20），促进了 MC3T3-E1 细胞的粘附和增殖， $Z\\mathrm{n}^{2+}$ 的释放增强了结构化CFRPEEK 表面BMSC 的成骨分化。  \n\n![](images/8cc834f8ed614dc9eacaa0a65671e23b4f8997b3165f5999448252ef91d9c9ef.jpg)  \nFigure 1.20 Surface views of CFRPEEK (a) and Zn–O (b) samples. The inset on the top right corner is high magnification of the sample [197].  \n\n$\\textcircled{2}$ HA、Ti 和二氧化钛（TiO2）  \n\n钛（Ti）具有高疲劳强度、生物相容性和促进骨生长的骨传导特性[198]。在Ti表面形成的二氧化钛氧化层可以促进 SBF 溶液中磷灰石的形成[199]。Ti 具有促进骨整合的优异能力，已经作为涂层应用于 PEEK 和 CFRPEEK 植入物。例如，Stefan 等[200]将等离子喷涂钛涂层的 PEEK 和 CFRPEEK 植入到绵羊骨盆中发现在 2 周和 12 周移除植入物所需的力显著增加，这说明钛涂层增加了 PEEK 和CFRPEEK 植入物与周围骨组织之间的结合力。Lu 等[201]利用高能离子轰击和表面微电荷协同作用在CFRPEEK 上制备了 $\\mathrm{TiO}_{2}$ 纳米孔（Figure 1.21）。纳米多孔的 CFRPEEK 表面促进 BMSC 的粘附、增殖和成骨分化。 $\\mathrm{TiO}_{2}$ 纳米颗粒独特的多层纳米孔结构还能够杀死金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。  \n\n![](images/e41ba465b268cc1536b37eea30dcde1933e0e60bf209c7b7168ce1cf8acb868f.jpg)  \nFigure 1.21 (a) Schematic illustration of the formation mechanism of nanopores with $\\mathrm{TiO}_{2}$ walls. (b) Cross-sectional morphology of CFRPEEK and Ti-120 samples [201].  \n\nHA 是骨骼的主要无机成分，是一种骨传导磷酸钙材料，不仅能够增强细胞粘附，还可以与周围骨骼整合[202]。由于 HA 能够与天然骨紧密结合，许多研究已经在 PEEK 植入物上制备 HA 涂层，以改善植入物的骨结合性能。Li 等[203]采用冷喷涂方法在形貌复杂的三维 PEEK 植入物表面制备了生物相容性 HA 涂层。将冷喷涂的HA-PEEK 脊椎笼植入小型猪的髂骨缺损中，植入物与周围骨的结合率和新生骨的骨密度显着提高。经过等离子喷涂 Ti 和/或HA 涂层的 PEEK 脊髓笼已被FDA 批准用于临床，这些涂层也被用于改善 CFRPEEK 的骨整合能力。  \n\n$\\textcircled{3}$ 蛋白质、多肽和/或药物  \n\n在聚醚醚酮及其复合材料表面附着的生物分子可以诱导特定的细胞反应。蛋白质和/或多肽涂层为细胞提供了粘附位点，在接下来的信号传导中起重要作用[204, 205]。具有促成骨作用的生物分子和蛋白质能够增强细胞粘附、增殖和成骨分化[206, 207]。  \n\n骨形态发生蛋白（BMP），如 BMP-2 和 BMP-7，能够促进骨折后的骨生成和修复[208, 209]。Shah 等[210]通过逐层沉积（LBL）方法在 PEEK 表面制备了含有HA 和BMP-2 的涂层，该涂层能够控制 BMP-2 的释放，避免了 BMP-2 局部的高浓度释放，极大地提高了 PEEK 的骨整合能力。BMP-2 的逐渐释放使其在周围骨基质中积累，从而在植入后第一个月促进了骨髓细胞的体外和体内成骨分化以及PEEK 植入物周围的新骨生成。  \n\n精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸（RGD）序列是纤连蛋白中发现的最小细胞粘附序列，能够促进细胞粘附[211]。将 RGD 肽共价固定在化学预处理的 PEEK 表面，显著改善了细胞的初始粘附和增殖[212]。Zhu 等[213]通过聚多巴胺（PDA）涂层将 RGD 肽共价接枝到 SPEEK 表面（Figure 1.22）。在第 7 天和第 14 天，RGD肽修饰的PEEK 促进细胞增殖，显著上调了碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素的基因表达，说明RGD 肽可以促进 MC3T3-E1 细胞成骨分化。  \n\n![](images/cb0de71c1f1218ccde4535420d6f730d06e88577935c7c8ec58ad45e06c9991b.jpg)  \nFigure 1.22 (a) Chemical structure of RGD peptide. (b) Schematic Diagram of the Preparation of a Functional PEEK Surface in Various Stages of Surface Modifications with the Chemical Structure Diagram of the RGD Peptide. (c) Biological function diagram of modified PEEK [213].  \n\n染料木素是一种天然存在于大豆中的异黄酮，可以促进新骨生成和成骨相关基因的表达。Cai 等[192]将染料木素负载到复合介孔镁-钙-硅酸盐生物玻璃的纳米孔中，并通过喷砂处理对PEEK 进行了表面改性。染料木素的掺入进一步增强了PEEK 的成骨性能，显著改善了 MC3T3-E1 细胞的粘附、增殖、ALP 活性和体内骨整合能力。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 25,
        "chunk": "# 1.4 水凝胶在骨组织工程中的应用研究  \n\n在骨骼的再生过程中，细胞外基质（ECM）在骨组织间的信号传递和物质交换中发挥着至关重要的作用[214]。水凝胶是水溶胀聚合物，具有通过各种交联反应形成的3D 网络结构，适用于细胞生长和生物活性分子的转移[215]。与骨修复过程中的其他生物活性材料相比，水凝胶材料在促进干细胞的粘附、增殖和分化能力方面具有天然的优势[216]。近年来，科研工作者利用理化方法制备了多种水凝胶，以增强骨再生能力[217-219]。  \n\n物理交联水凝胶是利用离子间相互作用、氢键结合、结晶等作用制备的水凝胶 [220, 221]。离子水凝胶是通过离子作为交联剂而形成的水凝胶。矿物质作为基本营养元素，对于维持正常的身体功能很重要。铁、铜、锌和钙等矿物离子在调节或维持细胞行为和生物体平衡方面起关键作用[222, 223]。将这些矿物离子引入到凝胶体系中不仅能起到交联剂的作用，还能调节骨组织愈合过程中的细胞行为和生理环境稳态。例如，Zhen 等[224]制备了一种铜掺杂双交联可注射水凝胶，用于骨组织修复。在植入初期，该水凝胶可用于光热治疗，光热剂的降解和铜离子的释放可以促进骨组织修复（Figure 1.23）。离子水凝胶最显著的特点是其自愈能力，凝胶网络可以在高剪切力下被破坏，并在剪切力去除后进行修复。由于离子相互作用是物理交联方法，较差的机械性能严重限制了这类水凝胶在骨和其他硬组织修复中的应用[225]。  \n\n![](images/b2d90b4fbfc04bbf0f8829103c91ee52ce0f8f5ae291413723d850cf3078b00e.jpg)  \nFigure 1.23 Schematic illustration for the formation of injectable SA/PEG-CuBGM composite hydrogels with photothermal therapy and bone regeneration [224].  \n\n温度响应型水凝胶会对温度做出反应，温度变化会使这类凝胶的体积发生变化[226]。温度响应型水凝胶在温度变化后具有独特的溶胶凝胶特性，所以特别适用于骨组织工程[227]。生物医学领域常见聚合物几乎没有热敏行为，通常将热响应链共价交联到聚合物中来制备温度响应型水凝胶。作为热响应聚合物的典型代表，聚 (N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAAm）因其温度在 $32^{\\circ}\\mathrm{C}$ （较低临界溶液温度）时的相平移能力成为最受欢迎的材料[228]。由于线性的 PNIPAAm 在室温下状态不稳定，所以要将 PNIPAAm 与其他聚合物链结合来提高其稳定性和机械性能[229]。例如，Ekerdt 等[230]将透明质酸（HA）掺入热响应水凝胶系统中以增强水凝胶基质的机械性能。HA-PNIPAAm 水凝胶的机械行为受到温度的调控以适应特定的干细胞分化，较硬的水凝胶对 BMSCs 的成骨分化有更好的促进作用（Figure1.24）。  \n\n![](images/738f25e126cc160251f47a8396d8462eb7956936b406eaeea1bb9575c07ff464.jpg)  \nFigure 1.24 (A) Schematic of HA-PNIPAAm. (B–D) The steps for cell encapsulation [230].  \n\n化学交联水凝胶是利用化学交联方法，使得水凝胶体系中的分子链之间形成共价键，包括小分子交联，光诱导交联等。与物理交联方法相比，通过化学交联方法制备的水凝胶具有优异的机械性能和稳定性[225]。在水凝胶体系中掺入特定的小分子交联剂，包括戊二醛、染料木酚、多巴胺和单宁酸（TA），是调节水凝胶功能和机械性能的有效方法。由于对细胞和组织的毒副作用，戊二醛的应用受到限制[231]。受贻贝生物粘附机制的启发，儿茶酚化合物（如多巴胺、咖啡酸）  \n\n因其官能团赋予其强大的表面粘附力而常被用于组织再生工程。例如，Li 等[232]制备的 $\\mathrm{Fe}_{3}\\mathrm{O}_{4}$ 纳米颗粒和多巴胺修饰的 PEG 水凝胶具有受控的机械性能和自愈能力，适用于那些软（皮肤伤口）或硬（骨缺损）组织。  \n\n光触发水凝胶是骨组织工程中最有前途的水凝胶之一。它可以由特定波长（紫外线或可见光）的光触发，并诱导凝胶三维网络的形成和形态变化[233]。由于原位凝胶化和简便的制备条件，该方法满足了骨相关疾病的各种要求。许多基于天然和合成的聚合物都用光响应交联基团改性。例如，Qiao 等[234]人在紫外光下通过成骨生长肽（OGP）和甲基丙烯酰化明胶（GelMA）之间的共价连接制备了一种新型 GelMA 水凝胶（Figure 1.25），这种光交联水凝胶不仅延长了 OGP的作用时间，而且为调节细胞行为提供了稳定的微环境，从而增强了骨缺损处新组织的再生。  \n\n![](images/2dda8f580506c9f79d777191659ea0e3823aaf19a31f8bbb778812aa41077bc6.jpg)  \nFigure 1.25 Flow chart of GelMA-c-OGP hydrogel construction and its mechanical properties [234].",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 26,
        "chunk": "# 1.5 本论文设计思想  \n\nCFRPEEK 复合材料因其优异的物理、化学、机械性能和与人体骨骼相匹配的弹性模量，被认为是潜在的骨科植入物，受到国内外研究人员的广泛关注。CFRPEEK 植入物的生物惰性导致它与骨组织和细胞的整合能力差，极大限制了其临床应用。改善CFRPEEK 植入物的生物惰性成为研究 CFRPEEK 复合材料作为骨科植入物的主流趋势。除此之外，在超过临界尺寸的骨缺损的愈合过程中，改性的 CFRPEEK 植入物应该能够协调不同愈合阶段（免疫、血管化和骨再生）以恢复缺损处的骨组织功能。从骨缺损愈合所需要的生物功能的角度出发，结合临床对超过临界尺寸骨缺损植入物的需求，本论文将通过磺化处理和紫外接枝等表面改性技术，用负载地塞米松的甲基丙烯酰化明胶-聚丙烯酰胺复合凝胶、氧化石墨烯-羟基磷灰石冷冻凝胶和金属有机框架水凝分别修饰 CFRPEEK，从而开发三种具有多功能生物活性凝胶修饰 CFRPEEK 骨科植入物，用于满足骨愈合环境下所需的多种生物功能，以拓宽 CFPEEK 复合材料在生物医学领域中的应用范围，为其临床应用提供了新的研发思路和科学参考。根据超过临界尺寸的骨缺损愈合过程中所需要的生物相容性和成骨能力，设计负载地塞米松的复合凝胶修饰CFRPEEK 植入物；在第一个工作基础上，为进一步提升骨缺损愈合过程中所需要的成血管和成骨能力，设计氧化石墨烯-羟基磷灰石冷冻凝胶修饰CFRPEEK 植入物；将在前两个工作基础上，为进一步提升骨缺损愈合过程中所需要的免疫调节、成血管和骨再生能力，设计 pH 响应性金属有机框架凝胶修饰CFRPEEK 植入物。将对制备的具有生物活性的多功能凝胶表面修饰 CFRPEEK植入物进行理化性能、体外生物学和体内骨缺损修复能力的探究，以期为CFRPEEK 植入物的开发及临床应用提供新的思路和建设策略。  \n\n1. 对于超过临界尺寸的骨缺损的治疗所需的植入物不仅需要它具备与骨骼适配的机械性能，还应该具有生物相容性和成骨能力。从提升骨愈合所需的生物相容性和成骨能力的角度出发，设计制备负载地塞米松的复合凝胶修饰CFRPEEK 植入物。采用磺化处理和紫外接枝的表面改性方法将负载地塞米松（Dex）的甲基丙烯酰化明胶/聚丙烯酰胺复合水凝胶（GelMA/PAAM）修饰到CFRPEEK 植入物上，构建出具有三维凝胶网络表面的 CFRPEEK 植入物。该三维凝胶网络的表面能够增强CFRPEEK 植入物的生物相容性和成骨能力。  \n\n2. 骨骼是一个高度血管化的组织，在骨缺损愈合的过程中还伴随着血管的重塑。在骨愈合过程中的血管生成不及时会造成氧气和营养物质的供应不足，从而导致后期的成骨能力差。从提升骨愈合所需的成血管和成骨能力的角度出发，设计制备氧化石墨烯-羟基磷灰石冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 植入物用于提高CFRPEEK 植入物的成血管和成骨能力。首先，通过原位键合的方法制备氧化石墨烯-羟基磷灰石（GO-HAP）纳米复合材料，再采用磺化处理和基于自由基光聚合的冷冻凝胶方法将负载氧化石墨烯-羟基磷灰石的冷冻凝胶接枝到 CFRPEEK植入物表面上，构建具有3D 海绵状大孔凝胶网络表面的CFRPEEK 植入物。该冷冻凝胶层主要由氧化石墨烯-羟基磷灰石（GO-HAP）纳米复合材料和甲基丙烯酰化明胶/聚乙二醇二丙烯酸酯（GelMA/PEGDA）组成。GO-HAP 纳米复合材料既能促进血管的新生又能提高成骨能力，并且 3D 海绵状大孔凝胶网络也能够促进血管的长入与迁移。  \n\n3. 骨缺损的愈合发生在良好的炎症、血管化和成骨分化的基础上，植入物在植入早期过度的炎症反应和不及时的血管化会影响后期新骨的生成。从提升骨愈合所需的抗炎、成血管和成骨分化的角度出发，设计制备 $\\mathsf{p H}$ 响应性金属有机框架（MOF）凝胶修饰CFRPEEK 植入物来增强 CFRPEEK 植入后的抗炎、血管化和成骨能力。首先，通过纳米羟基磷灰石（HAP）、没食子酸（GA）和镁离子（ $\\mathrm{(Mg^{2+})}$ ）之间的配位作用设计制备具有核壳结构的羟基磷灰石 $@$ 镁-没食子酸（ $\\mathbf{\\chi}_{\\mathrm{HAP}@\\mathbf{M}\\mathbf{g}-}^{\\prime}$ GA）金属有机框（MOF）纳米颗粒。然后，通过磺化处理和紫外接枝的方法对CFRPEEK 植入物进行表面改性，在 CFRPEEK 植入物上构建出负载 ${\\mathrm{HAP}}@{\\mathrm{Mg-}}$ GA MOF 纳米颗粒的水凝胶层。水凝胶基质选择的是具有 $\\mathfrak{p H}$ 响应性的甲基丙烯酰化壳聚糖，该凝胶基质可以随着骨缺损处生理环境 $\\mathsf{p H}$ 值的变化来控制HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒中 GA、 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 和 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放，从而提高 CFRPEEK植入物的抗炎、血管化和成骨分化能力。  \n\n本论文拟解决的CFRPEEK植入物的瓶颈问题以及具体的研究思路如Figure1.26 所示：",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 27,
        "chunk": "# 碳纤维增强聚醚醚酮植入物的瓶颈问题  \n\n生物情性导致它与骨组织和细胞的整合能力差，极大限制了其临床应用。  \n\n从骨缺损愈合所需要的生物功能的角度出发，结合临床对超临界尺寸骨缺损植入物的需求，构建具有多功能凝胶修饰碳纤维增强聚醚醚酮植入物。  \n\n![](images/f81fcc6ec79e3813db4cfd9feeb8951b9575c7771a041cadd1439957c10623db.jpg)  \nFigure 1.26 Schematic diagram of the main problems to be solved and the research methods of this paper.",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 28,
        "chunk": "# 第2 章 负载地塞米松的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备及其成骨能力的研究",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 29,
        "chunk": "# 2.1 前言  \n\n随着临床医学技术的发展，传统的金属骨科植入材料（如：钛和不锈钢）得到了广泛的应用[235]。这些植入物存在的一些缺点会导致植入失败，例如由于体内生理环境腐蚀而导致的金属离子释放、应力屏蔽和磁共振成像 （MRI） 不相容[236]。与传统的骨科植入物相比，本研究团队采用三维（3D）针刺方法制备的长碳纤维（ $\\mathrm{.40mm}\\cdot$ ）增强聚醚醚酮（CFRPEEK）是一种高性能复合材料，具有优异的机械强度 （ ${400}{-700}\\mathrm{MPa})$ ）、低密度 （ $1.43\\:\\mathrm{g}/\\mathrm{cm}^{3}$ ）和各向同性[237]。设计制备的 CFRPEEK（ $C\\mathrm{F}{:}30{-}60\\ \\mathrm{wt}^{\\mathrm{0}}\\mathrm{\\Omega}_{\\mathrm{0}}$ ）具有可调节的弹性模量（ $18{-}35\\ \\mathrm{GPa})$ ），接近于人类皮质骨的弹性模量（ ${\\sim}20\\mathrm{GPa})$ ），这会最大限度地减少应力屏蔽。除了优异的机械性能外，制备的 CFRPEEK 还保留了 PEEK 的优点，即无毒，化学稳定性，计算机断层扫描和MRI 兼容性[201, 238]，因此，CFRPEEK 在骨科植入物中具有广泛的潜在应用。CFRPEEK 复合材料具有生物惰性，与骨组织的结合较差，增加了松动的风险，最终会导致植入失败，从而限制了其临床应用[156, 178]。所以，有必要对制备的CFRPEEK 进行改性以获得具有生物功能的植入物，从而实现它的最佳临床应用。  \n\n材料的表面改性是一种非常有效的改进材料生物活性技术，利用这一技术可以提高CFRPEEK 的生物相容性和骨结合性。它可以在不改变材料优异性能的情况下改善材料与骨组织之间的结合性能[239]。对于 PEEK 及其复合材料，通过表面磺化处理和光诱导自由基接枝聚合等方法可以改善其生物活性。浓硫酸的磺化处理可以在PEEK 及其复合材料表面上制备多孔结构[177, 240, 241]。高能电子束，如紫外线或伽马射线等，可以破坏 PEEK 及其复合材料表面的化学键，从而在材料表面接枝活化的单体或聚合物，以增强 PEEK 及其复合材料的生物活性[242-246]。  \n\n甲基丙烯酰化明胶（GelMA）是一种可光聚合的明胶衍生物。GelMA 结构中包含的RGD 序列可以促进细胞粘附、增殖和分化，广泛应用于组织工程。尽管 GelMA 水凝胶表现出优异的生物相容性，但较快的降解速率限制了它在组织工程中的应用[247-249]。研究人员设计了由天然聚合物和合成聚合物制备的复合水凝胶，以调整GelMA 的降解性能，从而拓宽它的应用范围。GelMA 制备的复合水凝胶不仅具有生物相容性，还具有良好韧性[250-252]。聚丙烯酰胺（PAAM）水凝胶是一种光交联的合成聚合物水凝胶，具有优异的柔韧性和变形性能[253-256]。糖皮质激素是维持身体正常运转的重要物质。在正常情况下，糖皮质激素参与控制人体骨骼的生长和发育[257]。地塞米松（Dex）， 一种糖皮质激素， 广泛用于治疗传染病和免疫疾病。之前的一项研究发现，低浓度的 Dex 能够促进 BMSC细胞的成骨分化[258]。  \n\n本章设计了一种负载 Dex 的复合凝胶修饰 CFRPEEK 植入物，通过浓硫酸的磺化处理和紫外（UV）照射将 GelMA/PAAM 复合水凝胶接枝在 CFRPEEK 植入物的多孔表面上，随后通过浸泡 Dex 溶液将 Dex 负载在 CFRPEEK 表面的GelMA/PAAM 复合水凝胶上，从而提高 CFRPEEK 的生物相容性和成骨能力。对改性的CFRPEEK 植入物的宏观及微观形貌、亲水性、Dex 的长期控释能力和体外矿化能力进行了研究，探究了改性 CFRPEEK 植入物的体外生物相容性和成骨能力。通过大鼠临界颅骨缺损实验进一步研究了改性 CFRPEEK 植入物的骨修复及骨整合能力。Figure 2.1 为设计的技术路线示意图。  \n\n![](images/bd163fa166c8a28dff98db949416a11ba027fb0c9d0622a25d92c017fd4d1ab5.jpg)  \nFigure 2.1 Schematic illustration of the modification processes on the surface of",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 30,
        "chunk": "# 2.2 实验部分",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 31,
        "chunk": "# 2.2.1 实验材料与仪器",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 32,
        "chunk": "# 1.实验材料  \n\nTable 2.1 The materials and reagents.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>名称</td><td>缩写</td><td>产品规格</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>聚醚醚酮纤维</td><td>PEEK fiber</td><td>MI= 42 g/10min</td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>碳纤维</td><td>CF</td><td>T700-24k,</td><td>日本东丽</td></tr><tr><td></td><td></td><td>密度1.8 g/cm²,</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>细度1650 tex</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Gel</td><td>A 型,源自猪皮,</td><td>上海昂一生物科技有限</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td></td><td>试剂级</td><td>公司</td></tr><tr><td></td><td>AM</td><td>AR,99%</td><td>上海易恩化学技术有限 公司</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸酐</td><td>MA</td><td>AR, 94%</td><td>北京百灵威科技有限公</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>司</td></tr><tr><td>透析膜</td><td></td><td>12-14 kDa</td><td>赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司</td></tr><tr><td>浓硫酸</td><td>H2SO4</td><td>95~98%</td><td>北京化工厂</td></tr><tr><td>丙酮</td><td></td><td>AR</td><td>北京化工厂</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td></td><td>AR</td><td>北京化工厂</td></tr><tr><td>改良模拟体液</td><td>SBF</td><td>1.5X</td><td>飞净科技</td></tr><tr><td>罗丹明标记的</td><td></td><td>AR</td><td>翊圣生物科技</td></tr><tr><td>鬼笔环肽 4',6-二基-2-</td><td>DAPI</td><td>AR</td><td>索莱宝</td></tr><tr><td>苯基吲哚 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM</td><td></td><td>赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS</td><td></td><td>美国Clark 公司</td></tr></table></body></html>  \n\n<html><body><table><tr><td colspan=\"4\"></td></tr><tr><td>名称</td><td>缩写</td><td>产品规格</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td></td><td></td><td>赛默飞世尔科技 (中国)</td></tr><tr><td>CCK-8试剂盒</td><td>CCK-8</td><td></td><td>上海碧云天公司</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶试 ALP</td><td></td><td></td><td>上海碧云天公司</td></tr><tr><td>剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT染色</td><td></td><td></td><td>上海碧云天公司</td></tr><tr><td>试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化十六烷基</td><td></td><td></td><td>上海碧云天公司</td></tr><tr><td>吡啶 Trizol试剂</td><td></td><td></td><td>赛默飞世尔科技 (中国)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>有限公司</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScriptTM</td><td></td><td></td><td>日本 Takara Bio 公司</td></tr><tr><td>RT试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TB GREEN 试</td><td></td><td></td><td>日本 Takara Bio 公司</td></tr><tr><td>剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏木精-伊红染 H&E</td><td></td><td></td><td>武汉赛维尔生物科技有</td></tr><tr><td>色剂</td><td></td><td>限公司</td><td></td></tr><tr><td>Van Gieson 染色</td><td></td><td></td><td>武汉赛维尔生物科技有</td></tr><tr><td>试剂盒</td><td></td><td>限公司</td><td></td></tr><tr><td>Masson 三色染</td><td></td><td></td><td>武汉赛维尔生物科技有</td></tr><tr><td>色试剂盒</td><td></td><td>限公司</td><td></td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 33,
        "chunk": "# 2. 实验仪器  \n\nTable 2.2 The experimental apparatus.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>型号</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>真空热压机</td><td>P 400PV</td><td>德国科林</td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>YQ-1003A</td><td>上海易净超声波仪器有限公司</td></tr><tr><td>真空干燥箱</td><td>DZF-6050</td><td>上海博迅实业有限公司</td></tr><tr><td>真空冷冻干燥机</td><td>SCIENTZ-10 N</td><td>宁波新芝生物科技有限公司</td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>10 mW/cm²，365nm</td><td>中山市宇固电器厂</td></tr></table></body></html>  \n\n第2 章 负载地塞米松的复合水凝胶修饰CFRPEEK 的制备及其成骨能力的研究  \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>型号</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>核磁共振波谱仪</td><td>400MHz</td><td>德国 Bruker 公司</td></tr><tr><td>场发射扫描电子显微</td><td>Nova Nano</td><td>450美国 FEI公司</td></tr><tr><td>镜</td><td>(SEM)</td><td></td></tr><tr><td>能量色散X射线谱仪</td><td>S2 RANGER (EDS)</td><td>德国布鲁克</td></tr><tr><td>傅里叶红外光谱仪</td><td>iS10 (ATR-FTIR)</td><td>赛默飞世尔科技（中国)有限公</td></tr><tr><td></td><td></td><td>司</td></tr><tr><td>X射线光电子能谱仪</td><td>AHIS-HS (XPS)</td><td>英国 Kratos 公司</td></tr><tr><td>电子万能材料试验机</td><td>AGX</td><td>日本岛津株式会社</td></tr><tr><td>静态接触角测量仪</td><td>SL200B</td><td>上海梭伦信息科技有限公司</td></tr><tr><td>恒温摇床</td><td>OS-60</td><td>莱普特科学仪器有限公司</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>UV-1900i</td><td>日本岛津株式会社</td></tr><tr><td>恒温培养箱</td><td>371</td><td>赛默飞世尔科技（中国）有限公</td></tr><tr><td></td><td></td><td>司</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微 镜</td><td>FV3000</td><td>日本奥林巴斯株式会社</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>iMark</td><td>美国 Bio-Rad 公司</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td></td><td>美国 Bio-Rad 公司</td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR480</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>美国罗氏公司</td></tr><tr><td>仪</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Skyscan 1172</td><td>德国 Bruker 公司</td></tr><tr><td>脱水机</td><td>Donatello</td><td>DIAPATH</td></tr><tr><td>包埋机</td><td>JB-P5</td><td>武汉俊杰电子有限公司</td></tr><tr><td>组织切片机</td><td>SP1600</td><td>德国徕卡仪器有限公司</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 34,
        "chunk": "# 2.2.2 磺化 CFRPEEK 复合材料的制备  \n\n长碳纤维PEEK 纤维的重量比为30:70 的CFRPEEK 复合材料的模量与皮质骨的模量最接近。选择这一比例按照本研究团队之前报道的方法[237]制备CFRPEEK 复合材料。（Figure 2.2）  \n\n（1）将PEEK 长纤维（ $70\\mathrm{wt\\%}$ ，长 $40\\mathrm{mm}$ ）和碳纤维长纤维（ $30\\mathrm{wt\\%}$ ，长$40\\mathrm{mm}$ ）通过混合、梳理、铺设和针刺制备 3D CFRPEEK 复合针刺毡；（2）将针刺毡修整成专用模具的尺寸，放入真空热压机中进行热压成型。热压的工艺参数设定如下：成型温度为 $400^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，成型时间为 $20\\mathrm{min}$ ，冷却速度为$20^{\\circ}\\mathrm{C/min}$ ，成型压力为 $4\\mathrm{MPa}$ ；（3）通过脱模得到黑色的板状 CFRPEEK 复合材料；（4）为了去除 CFRPEEK 复合材料表面污染物，体外和体内探究中使用的CFRPEEK 样品依次在超声波清洗器中用丙酮，乙醇和超纯水清洗，各 $10~\\mathrm{min}$ ；（5）在室温下，CFRPEEK 样品在浓硫酸中磁力搅拌 $5\\mathrm{min}$ ，以获得均匀的多孔表面；（6）反应后的 CFRPEEK 样品依次浸入超纯水和丙酮中，并在超声波清洗器中清洗；（7）将得到的磺化 CFRPEEK 复合材料在真空干燥箱中 $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ 干燥 24 小时以备后续使用；（8）尺寸为 $\\Phi14\\times1.5\\mathrm{mm}$ 的磺化CFRPEEK 用于表面表征和体外细胞实验，尺寸为 $\\Phi5{\\times}1.5\\ \\mathrm{mm}$ 的磺化 CFRPEEK 用于动物体内实验。  \n\n![](images/b193835ec0868fc1669aa581e370558102acec99fc291d18a6a844826f76d73d.jpg)  \nFigure 2.2 Schematic diagram of preparation process of 3D needle-punched CFRPEEK composite[237].",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 35,
        "chunk": "# 2.2.3 甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的制备与表征  \n\n甲基丙烯酰化明胶（GelMA）按照文献报道的方法制备（Figure 2.3） [259]。  \n\n在 $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，5 克明胶于50 毫升磷酸盐缓冲溶液（PBS，CELLCOOK，中国）中溶解；向明胶溶液中缓慢滴入 4 毫升甲基丙烯酸酐， $50^{\\circ}\\mathrm{C}$ 磁力搅拌 3 小时进行酰化反应；在 $50^{\\circ}\\mathrm{C}$ 下，将反应完的溶液用 200 毫升的PBS 稀释，装入透析袋中用去离子水透析3 天，以除去未反应的甲基丙烯酸酐；将透析后的反应液在真空冷冻干燥机中冻干，获得白色泡沫状的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）。  \n\n![](images/45d7b557cafe0c7299419c1aee18ca9d21bfb8def68b3ba686db3fbe35645ed2.jpg)  \nFigure 2.3 The fabrication synthesis of GelMA.  \n\n在常温条件下，将少量的明胶和甲基丙烯酸酰化明胶分别溶解于氘代重水（ $\\mathrm{\\cdot}\\mathrm{D}_{2}\\mathrm{O}),$ ），通过 $400\\mathrm{MHz}$ 核磁共振波谱仪来测试样品的 $\\mathrm{^{1}H N M R}$ 光谱，以确定所制备的甲基丙烯酸酰化明胶（GelMA）的分子结构。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 36,
        "chunk": "# 2.2.4 负载 Dex 的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备  \n\n负载Dex 的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备按照如下步骤操作：  \n\n在避光条件下，将 GelMA 和 AM 按照 $10{:}5\\mathrm{\\wt\\%}$ 的比例溶解到去离子水中，得到无色透明的 GelMA/AM 凝胶前体液；将按照 2.2.2 制备的磺化 CFRPEEK 浸入到 GelMA/AM 凝胶前体液中；将含有磺化 CFRPEEK 的混合溶液置于波长为$365~\\mathrm{nm}$ 、光强度为 $10\\mathrm{\\mW/cm}^{2}$ 的紫外灯下 45 分钟；为了去除未反应的 GelMA和AM，将接枝后的样品浸入到去离子水中；将紫外接枝后的样品在浓度为 250$\\upmu\\mathrm{g/mL}$ 的Dex 溶液中孵育24 小时；最后，在真空冷冻干燥机中冻干孵育后的样品。  \n\n各组CFRPEEK 样品用如下缩写表示：  \n\nCP:未经处理的 CFRPEEK 复合材料; SCP: 磺化 CFRPEEK 复合材料;  \nSCP/GP: GelMA/PAAM 复合水凝胶接枝的磺化 CFRPEEK 复合材料;  \n\nSCP/GP/Dex: 负载 Dex 的 GelMA/PAAM 复合水凝胶接枝的磺化 CFRPEEK复合材料。  \n\n采用场发射扫描电子显微镜（SEM）对各组样品的表面形貌和截面形貌进行表征；X 射线光电子能谱仪（XPS）和全反射傅里叶红外光谱仪（ATR-FTIR）用于表征各组样品的表面化学组成；使用接触角测量仪测量每组试样的水接触角，每个试样测量3 个不同的区域，每组试样重复测量 2 次。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 37,
        "chunk": "# 2.2.5 力学性能测试  \n\n使用AGX电子万能材料试验机测定CFRPEEK在表面改性前后的机械性能，所有机械性能测试均在 $23^{\\circ}\\mathrm{C}$ 和 $50\\%$ 相对湿度下进行。  \n\n拉伸性能参照 ASTM-D3039 进行测量，将各组样品切割成 $150\\ \\mathrm{mm}\\times\\ 12.5$ $\\mathrm{mm}{\\times}1.5\\mathrm{mm}$ 的样条，拉伸测试速率为 $1\\mathrm{mm/min}$ 。弯曲性能根据 ASTM-D7264 使用三点弯曲法测量，各组样条的尺寸为 $120\\mathrm{mm}{\\times}12.5\\mathrm{mm}{\\times}3\\mathrm{mm}$ ，弯曲测试的加载速度为 $1\\mathrm{mm/min}$ 。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 38,
        "chunk": "# 2.2.6 Dex 释放行为研究  \n\n（1）在进行Dex 释放实验之前，首先测量复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的Dex负载率。将复合水凝胶修饰CFRPEEK 置于 $4\\mathrm{mL}$ 浓度为 $250~\\upmu\\mathrm{g/mL}$ 的 Dex 溶液中，随后将其放在 $25^{\\circ}\\mathrm{C}.$ 恒温摇床上，以 $50~\\mathrm{rpm}$ 的速度匀速振荡；孵育 $24\\mathrm{~h~}$ 后，取出载药的复合水凝胶修饰CFRPEEK；使用紫外-可见分光光度计测量剩余Dex溶液在 $240~\\mathrm{nm}$ 处的吸光度。复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的Dex 负载率的计算公式如下：  \n\nDex 负载率（%）= （M0-MT） $\\mathrm{'}\\mathbf{M}_{0}\\times100\\%$ ·  \n\n其中 MT 为剩余 Dex 溶液的药物质量， $\\mathbf{M}_{0}$ 为总的药物质量。最后，计算出的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的 Dex 负载率为 $28.77\\%$ 。  \n\n（2）对于体外 Dex 释放实验，将 SCP/GP/Dex 样品浸入到装有 2 mL PBS 的离心管中，置于 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 的恒温摇床以 $100\\mathrm{rpm}$ 的速度振荡；在预定时间收集含有释放 Dex 的 PBS，并加入等体积的新鲜 PBS；通过紫外-可见分光光度计测量释放的Dex 浓度。按照如下公式计算 Dex 的释放效率：  \n\nDex 的释放效率 $(\\%)\\ =\\mathrm{Rt}/\\mathrm{R}_{0}{\\times}100\\%$  \n\n其中 $\\mathbb{R}_{\\mathrm{t}}$ 为释放的 Dex 的质量， ${\\bf R}_{0}$ 为复合水凝胶修饰 CFRPEEK 负载的 Dex的总质量。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 39,
        "chunk": "# 2.2.7 体外矿化行为研究  \n\n将 CP、SCP、SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 浸入到 $2\\mathrm{mL}$ 的 SBF 溶液中，置于 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 恒温摇床中，以 $100\\mathrm{rpm}$ 的速度匀速振荡；每两天更换等量新鲜的 SBF 溶液，在14 天后，将试样取出，在真空冷冻干燥机中冷冻干燥；利用 SEM 及能量色散光谱仪（EDS）测量试样的微观形貌和化学构成。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 40,
        "chunk": "# 2.2.8 细胞实验",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 41,
        "chunk": "# 2.2.8.1 骨髓间充质干细胞（BMSC）的提取、培养与传代  \n\n细胞实验采用的细胞是从 Sprague Dawley（SD）大鼠提取出的 BMSC 细胞。SD 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，性别为雄性，体重为 $100\\mathrm{g}$ 左右。提取的步骤如下：  \n\n（1）采用深度麻醉状态下颈椎脱臼法处死大鼠，在 $75\\%$ 乙醇中浸泡 $10\\mathrm{min}$ 消毒；（2）将大鼠转移至超净台中，取出大鼠的两根胫骨及两根股骨，用手术器械去除长骨上附着的肌肉组织；（3）用剪刀剪去长骨两端，将骨髓腔内的细胞用含有 $1\\%$ 青霉素-链霉素和$10\\%$ FBS 的DMEM 完全培养基冲洗到培养皿内；（4）在 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 和 $5\\%$ $\\mathrm{CO}_{2}$ 的细胞培养箱中培养提取的细胞，首次更换培养基在72 小时后，此后2 天更换一次；（5）当培养皿中的贴壁 BMSC 细胞达 $90\\%$ 融合时，吸出全部完全培养基，再用PBS 洗涤；（6）将 $0.25\\%$ 胰蛋白酶加入到培养皿中，消化 1\\~2 分钟，用倒置显微镜观察细胞，当细胞开始变圆时，加入完全培养基，终止胰蛋白酶消化；（7）用吸管反复吹吸消化后的细胞，收集细胞于 $15\\mathrm{mL}$ 离心管中，用离心机以 $1000\\mathrm{rpm}$ 离心 $5\\mathrm{min}$ ，弃上清液。  \n\n（8）在完全培养基中重悬细胞，以 $2{\\sim}5{\\times}10^{5}\\mathrm{cell/ml}$ 的密度传代到新的培养皿中，此时得到的是第一代 BMSC 细胞，本细胞实验中采用的是第三代 BMSC细胞。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 42,
        "chunk": "# 2.2.8.2 细胞相容性测试  \n\n1. CCK-8 试剂盒用于检测材料表面BMSC 细胞的增殖情况。操作步骤如下：（1）将处在对数生长期的第三代 BMSC 细胞制成密度为 $1{\\times}10^{4}~\\mathrm{cell/mL}$ 细胞悬液;（2）将经过 Cobalt 60 灭菌（15KGy， $20\\mathrm{h}$ ）的样品放入 24 孔培养板中，用PBS 清洗一遍后，每孔滴加 $1\\mathrm{mL}$ 细胞悬液;（3）将培养板置于培养箱中，每 2-3 天更换培养基;（4）细胞培养1、4 和7 天后，向培养板中加入 $100\\upmu\\mathrm{L}$ 含有 $10\\%$ CCK-8 溶液的新培养基；（5）在培养箱中孵育 $2\\mathrm{h}$ 后，从每孔吸出 $100\\upmu\\mathrm{L}$ 培养基，放入 96 孔板中，使用酶标仪测量各孔的吸光度。2. 通过扫描电镜（SEM）观察 BMSC 细胞在材料表面的生长情况，具体操作步骤如下：（1）（2）（3）和上述CCK-8 的实验步骤相同；（4）细胞培养1 和4 天后，吸去培养基，用PBS 轻轻冲洗样品，再用电镜固定液固定 $2\\mathrm{h}$ ；（5）吸出固定液，样品在生物组织快速脱水仪中脱水，再在临界点干燥仪内干燥；（6）将样品固定在样品台上，放入离子溅射仪中喷金，随后用 SEM 进行观察。3. BMSC 细胞在不同样品上的粘附与扩散用罗丹明标记的鬼笔环肽和 DAPI染色法进行检测。方法如下：（1）（2）（3）和上述CCK-8 的实验步骤相同；（4）7 天后，吸出培养基，用PBS 轻轻冲洗样品，用 $4\\%$ 多聚甲醛溶液固定样品表面的细胞 $30\\mathrm{min}$ ；  \n\n（5）吸除 $4\\%$ 多聚甲醛溶液，再用 PBS 清洗样品，向孔板中加入 $0.5\\%$ 的TritonX-100 通透 $15\\mathrm{min}$ ，吸除 TritonX-100 后用 PBS 清洗样品表面；  \n\n（6）将 $100~\\mathrm{{nM}}$ 的 $200~\\upmu\\mathrm{L}$ 罗丹明标记的鬼笔环肽溶液加入到孔板中，以染色细胞膜上的F-肌动蛋白， $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 孵育 $^{\\textrm{1h}}$ ，再用PBS 清洗样品表面；  \n\n（7）将 $200\\upmu\\mathrm{L}5\\upmu\\mathrm{g/mL}$ 的 DAPI 溶液加入到孔板中，以对细胞核进行复染，$5\\mathrm{min}$ 后吸去染色液，并用PBS 清洗;  \n\n（8）用激光共聚焦显微镜观察细胞在样品上的粘附扩散情况，并拍照留存。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 43,
        "chunk": "# 2.2.8.3 体外成骨性能测试  \n\n1. 通过碱性磷酸酶（ALP）活性定量和染色实验检测BMSC 细胞在不同样品表面的早期成骨分化情况，具体操作步骤如下：  \n\n（1）将处在对数生长期的第三代 BMSC 细胞制成密度为 $3{\\times}10^{4}$ cell/mL 细  \n胞悬液；（2）将经过Cobalt 60 灭菌的样品放入24 孔培养板中，用PBS 清洗一遍后，  \n每孔滴加1 mL 细胞悬液；（3）培养板放入培养箱 $24\\mathrm{h}$ 后，完全培养基更换为成骨诱导培养基，其中  \n成骨诱导培养基：向完全培养基中添加 $50\\upmu\\mathrm{M}$ 维生素C， $10\\mathrm{mM}\\upbeta$ -甘油磷酸钠和  \n$100~\\mathrm{{nM}}$ 地塞米松；（4）培养 7 天和 14 天后，收集成骨诱导培养基，用 PBS 清洗孔板中各组  \n样品， $4\\%$ 多聚甲醛固定30 分钟，再用 PBS 清洗；（5）根据BCIP / NBT 染色试剂盒说明配制工作液，在每孔中加入 1mL 工  \n作液，并置于 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 水浴箱放置 45 分钟；（6）弃去染色工作液，用 PBS 冲洗，晾干，拍照；（7）按照 ALP 试剂盒说明书检测收集的成骨诱导培养基中 ALP 的活性，  \n用酶标仪检测 $520\\mathrm{nm}$ 处的 OD 值。2. 通过茜素红（ARS）染色和定量分析检测 BMSC 细胞在不同样品表面的  \n晚期成骨分化情况，具体操作步骤如下：（1）（2）（3）和上述碱性磷酸酶（ALP）活性定量和染色实验步骤相同；（4）各组样品与 BMSC 细胞共培养 21 天后，吸除成骨诱导培养基，每组  \n\n样品用 PBS 洗涤， $4\\%$ 多聚甲醛固定 $30\\mathrm{min}$ ，然后用PBS 洗涤；  \n\n（5）每孔加 $0.1\\%$ 茜素红溶液 $1\\mathrm{mL}$ ， $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 水浴 $45\\mathrm{min}$ ；  \n\n（6）用PBS 洗涤，去除多余的染液，晾干，拍照；  \n\n（7）拍照后的样品浸没在 $1\\mathrm{mL}10\\%$ （w/v）氯化十六烷基吡啶溶液中，在$37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 下溶解样品上的染色，3 小时后用酶标仪检测 $550\\mathrm{nm}$ 处的 OD 值。  \n\n3. 通过实时荧光定量分析聚合酶链式反应（RT-PCR）来探究BMSC 细胞在不同样品表面的成骨相关基因的表达情况，具体操作步骤如下：  \n\n（1）（2）（3）和上述碱性磷酸酶（ALP）活性定量和染色实验步骤相同；（4）总 RNA 提取  \n\n培养7 天和14 天后，吸出成骨诱导培养基，每组样品用 PBS 清洗，加入 1mL Trizol 试剂，用枪头吹破细胞，移至离心管中；将离心管置于高速离心机，以 $12000~\\mathrm{rpm}$ 速度离心 $10~\\mathrm{min}$ ，收集上清液，加入 $250~\\upmu\\mathrm{L}$ 氯仿，混匀，静置 3min，再次离心 $10\\mathrm{min}$ ，将 $400{\\upmu\\mathrm{L}}$ 上清液转移到新的EP 管中；向上清液中加入等体积异丙醇，混匀， $-20^{\\circ}\\mathrm{C}$ 静置 $15\\mathrm{min}$ ， $12000\\mathrm{rpm}$ 离心 $10\\mathrm{{min}}$ ，管底白色沉淀为RNA；弃去上层液体，加入 $75\\%$ 乙醇洗涤沉淀， $12000\\mathrm{rpm}$ 离心 $5\\mathrm{min}$ ，重复2 次；将离心管置于超净台上吹 $3\\mathrm{min}$ ，加入 $15\\upmu\\mathrm{LRNA}$ 溶解液溶解 RNA， $55^{\\circ}\\mathrm{C}$ 孵育 $5\\mathrm{min}$ ；提取的 RNA 浓度和纯度使用 Nanodrop 2000 检测。  \n\n（5）反转录 cDNA  \n\n将 Table 2.3 逆转录反应体系均匀混合，放入 PCR 仪，设定程序： $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 15min， $85^{\\circ}\\mathrm{C}\\ 5\\ \\mathrm{sec}$ ， $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 保存。  \n\nTable 2.3 Reverse transcription reaction system.   \n（6）RT-PCR   \n\n\n<html><body><table><tr><td>反应试剂</td><td>体积（μL)</td></tr><tr><td>5× PrimeScript RT Master Mix （Perfect Real Time）</td><td>２</td></tr><tr><td>100 ngTotalRNA对应的体积</td><td>X</td></tr><tr><td>RNase Free dH2O</td><td>8-X</td></tr></table></body></html>  \n\n按 Table 2.4 配制 PCR 反应液，并加入到 Roche 480 孔板内；  \n\nTable 2.4 The PCR reaction system.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>反应试剂</td><td>体积(μL)</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II</td><td>10</td></tr><tr><td>上游引物</td><td>0.8</td></tr><tr><td>下游引物</td><td>0.8</td></tr><tr><td>ROX Reference Dye or Dye II</td><td>0.4</td></tr><tr><td>cDNA 溶液</td><td>２</td></tr><tr><td>RNase Free dH2O</td><td>６</td></tr></table></body></html>\n\n将孔板置于 RT-PCR 仪内，程序设置： $95^{\\circ}\\mathrm{C}$ 预变性 30 sec，PCR 反应 $95^{\\circ}\\mathrm{C}$ 下 3 sec，然后 $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ 下 $30\\mathrm{sec}$ ，共经历 40 个循环；  \n\n通过 $2^{\\wedge}{\\lrcorner}\\Delta\\Delta\\mathrm{Ct}$ 法计算目的基因的表达量。  \n\n（7）RT-PCR 所需的成骨相关基因的引物对，如表 Table 2.5  \n\nTable 2.5 Primer pairs used in real-time PCR analysis.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>Genes</td><td>Sequence (5'-3')</td></tr><tr><td>ALP</td><td>F: ATCGGAACAACCTGACTGACC</td></tr><tr><td rowspan=\"2\">Col-I</td><td>R: CTGCCTCCTTCCACTAGCAA F: ATGCCATCAAGGTCTACTGCAA</td></tr><tr><td>R: GAACCTTCGCTTCCATACTCG</td></tr><tr><td rowspan=\"2\">GAPDH</td><td>F: TATGACTCTACCCACGGCAAG</td></tr><tr><td>R: ATACTCAGCACCAGCATCACC</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 44,
        "chunk": "# 2.2.9 大鼠颅骨缺损实验",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 45,
        "chunk": "# 2.2.9.1 建立大鼠颅骨缺损模型  \n\n动物实验采用大鼠颅骨缺损实验模型来探究负载 Dex 的复合水凝胶修饰CFRPEEK 植入物的体内成骨能力。动物实验的所有程序均经吉林大学实验动物福利与伦理委员会批准（批准号：2021129），并按照相关机构指南和法律进行。将24 只购买自北京维通利华的雄性 SD 大鼠（8 周，体重 $200{\\pm}25\\mathrm{g}$ ）随机分为四组：CP，SCP，SCP/GP 和SCP/GP/Dex。所有动物均用异氟烷麻醉，颅骨用碘伏消毒，在颅骨中央做 $3\\ \\mathrm{cm}$ 纵切口，钝性剥离皮下组织，露出颅骨骨板。使用外径为 $5\\mathrm{mm}$ 去骨钻在颅骨中缝两侧造出 2 个全层圆形骨膜骨质缺损。将植入物随机植入缺损部位（Figure 2.4）。大鼠在 4 周和 12 周被安乐死，然后收集含有样品的头骨和内脏（心、肝、脾、肺和肾），并固定在 $4\\%$ 多聚甲醛中以进行后续分析。  \n\n![](images/ba40deabe3ba415ab34ce4dbb86d8897c10006e1bfcb82e45287fb95ab96cb21.jpg)  \nFigure 2.4 Construction of the rat cranial defect model.",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 46,
        "chunk": "# 2.2.9.2 显微计算机断层扫描 （micro-CT）  \n\n通过 micro-CT 扫描固定后的头骨，扫描图像经过 NRecon 软件和 CTvox 软件处理，以重建颅骨缺损的2D 和3D 图像。利用 CTAn 软件计算新骨的骨参数：骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 47,
        "chunk": "# 2.2.9.3 组织学研究",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 48,
        "chunk": "# 1. 颅骨硬组织切片及染色  \n\n将颅骨组织先经过乙醇梯度脱水，再用二甲苯脱水 $12\\mathrm{h}$ ；将脱水后的组织放入浸塑液中，在 $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 浸塑 $24\\mathrm{~h~}$ ，重复 3 次；将浸塑后的颅骨组织放入包埋瓶中，加入适量的包埋液进行包埋；通过硬组织切片机常规切片，厚度约 $10\\upmu\\mathrm{m}$ ，将切片置于 $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ 烘箱中烘干；切片用 Van Gieson 染色，Masson 三染色和 H & E 染色法进行染色；通过显微镜镜检，采集图像并分析颅骨缺损的修复情况。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 49,
        "chunk": "# 2. 内脏石蜡切片及染色  \n\n新鲜内脏用固定液固定 $24\\mathrm{~h~}$ 以上，将内脏从固定液取出放于脱水盒内；将脱水盒放进脱水机内使用乙醇对内脏梯度脱水，乙醇的浓度次序为 $75\\%85\\%$ -  \n\n$90\\%{-}95\\%{-}100\\%$ ，然后将脱水的内脏浸没在融化的石蜡中；浸蜡后，将内脏组织在包埋机内包埋；包埋好的内脏组织用石蜡切片机切片，厚度为 $4~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ；采用 H& E 染色法对切片染色；最后，通过倒置显微镜获取染色切片的图像。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 50,
        "chunk": "# 2.2.10 统计与分析  \n\n使用 SPSS v10.0 对数据进行统计分析。数据以 $\\mathrm{SD\\pm}$ 平均值表示，使用单因素方差分析比较测量值。 $^{*}p<0.05$ 表示具有统计学意义。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 51,
        "chunk": "# 2.3 结果与讨论",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 52,
        "chunk": "# 2.3.1 甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的制备  \n\n明胶和甲基丙烯酰化明胶的 $\\mathrm{^{1}H N M R}$ 谱如 Figure 2.5 所示。在 GelMA 的 $^1\\mathrm{H}$ NMR 谱中可以观察到在 $5.4\\mathrm{ppm}$ 和 $5.6\\mathrm{ppm}$ 处有清晰可见的峰(Figure 2.5a)，这是 $\\mathrm{CH}_{2}{=}\\mathrm{CH}\\left(\\mathrm{CH}_{3}\\right)$ 的质子峰。 $1.87\\mathrm{ppm}(\\mathrm{Figure}2.5\\mathbf{b})$ 的峰值对应的是甲基丙烯基中的甲基，这说明甲基丙烯基已被接枝到明胶的分子链上。  \n\n![](images/b35c9345cf9e8657c68fd998ab4b61e59226eedd8c71e13941fc3a38d2fdb9cf.jpg)  \nFigure 2.5 $\\mathrm{^{1}H}$ NMR spectra of gelatin and GelMA.  \n\n2.3.2 负载 Dex 的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备  \n\nFigure 2.6 是经过磺化处理和紫外接枝的不同 CFRPEEK 样品的实物图和SEM 图像。CP 具有黑色平滑的表面。磺化处理后，SCP 变为白色粗糙的表面。  \n\n紫外接枝后，SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 表面被白色的水凝胶覆盖。与表面相对平坦的CP 不同，在 SCP 表面上观察到粗糙的多孔结构和许多暴露的碳纤维。在紫外接枝后，SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 表面形成了三维复合水凝胶网络。  \n\n![](images/0000fc37fa11cf299546ee81218ec2f7573c7d2a648acd58a02ad4856e7022ae.jpg)  \nFigure 2.6 SEM images of: CP, SCP, SCP/GP and SCP/GP/Dex, at high and low magnifications and the macroscopic views of each sample.  \n\nCP、SCP 和 SCP/GP 样品经过切片后的横截面如 Figure 2.7 所示。在 SCP 样品的横截面图像中可以观察到浓硫酸的扩散途径。在 SCP/GP 样品上可以观察到3D 多孔GelMA/PAAM 复合水凝胶网络，水凝胶层的厚度约为 $50\\upmu\\mathrm{m}$ 。由于复合水凝胶的接枝，SCP 顶层的孔被水凝胶网络填充。  \n\n![](images/4325afe64cd7f8e0a69221767b2659f1d1f66d766347a6f0e4d189e84b9ae5fd.jpg)  \nFigure 2.7 SEM images of different sample cross-sections: (a) CP, (b) SCP, and (c)  \n\nFigure 2.8 是不同 CFRPEEK 样品的 ATR-FTIR 光谱图。在 CP 和 SCP 光谱中，二苯甲酮的吸收峰出现在 $1593\\mathrm{cm}^{-1}$ 、 $1486\\mathrm{cm}^{-1}$ 和 $925\\mathrm{cm}^{-1}$ 处，在 $1184\\mathrm{cm}^{-1}$ 和 $1156~\\mathrm{cm}^{-1}$ 处的峰值则对应的是 C-O-C，在 $1600~\\mathrm{{cm}^{-1}}$ 处检测到苯的 $\\scriptstyle{\\mathrm{C=C}}^{[240}$ ,260]。在 SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 中， $1237~\\mathrm{cm}^{-1}$ 和 $1538~\\mathrm{cm}^{-1}$ 的峰值与 GelMA 结构中的酰胺Ⅰ和Ⅱ和Ⅲ键的N-H 的伸缩振动有关， $1646\\mathrm{cm}^{-1}$ 的峰值与 GelMA 结构中的酰胺Ⅲ键的 $\\scriptstyle{\\mathrm{C=O}}$ 的伸缩振动有关， $2930~\\mathrm{cm}^{-1}$ 处的峰值对应的是 C-H，在 $3294~\\mathrm{{cm}^{-1}}$ 观察到 N-H，这表明 SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 表面有大量氢键[261,262]。ATR-FTIR 结果表明，GelMA/PAAM 已经成功接枝到磺化 CFRPEEK 表面。  \n\n![](images/0eb9797c64c8d2ebe04c6fd3a5b902ae8dc06ed60ae6956a59ec9215e81530e7.jpg)  \nFigure 2.8 ATR-FTIR spectra of CP, SCP, SCP/GP and SCP/GP/Dex.  \n\nFigure 2.9 和 Table 2.6 是 CP、SCP、SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 样品的 XPS检测结果。如 Figure 2.9a 所示，在不同样品的 XPS 谱图中观察到 C 1s（284.6eV）、N 1s（ $400.0\\ \\mathrm{eV}.$ ）、O 1s（ $533.0\\ \\mathrm{eV}$ ）、S 2p（ $167.1\\ \\mathrm{eV}$ ）和 F 1s（ $686.7\\ \\mathrm{eV})$ ）峰。除碳元素和氧元素外，在 SCP 表面还观察到硫元素，这是 CFRPEEK 经过浓硫酸磺化处理造成的。与 CP 和 SCP 相比，在 SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 表面均检测到氮元素，这表明 GelMA/PAAM 复合水凝胶已成功接枝到 CFRPEEK 上。Figure 2.9b 和 Table 2.6 分别为 SCP/GP/Dex 的高分辨率氟峰（F 1s）光谱和不同样品的元素含量。结果表明，SCP/GP/Dex 中的碳和氧元素的含量相较于 SCP/GP增加，氮元素的含量减少，还检测到了 $1.43\\%$ 的氟元素，表明 Dex 已成功负载到CFRPEEK 上。XPS 分析结果表明成功制备了负载 Dex 的复合水凝胶修饰CFRPEEK。  \n\n![](images/66f069197f9540e5f6f5c41b09edae90c34668482cb1dc7c027974e68a060e13.jpg)  \nFigure 2.9 (a) XPS spectra of CP, SCP, SCP/GP, SCP/GP/Dex and (b) high-resolution fluorine peak (F 1s) spectra of SCP/GP/Dex.  \n\nTable 2.6 Elemental composition of different substrate surfaces as determined by XPS.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>Sample</td><td>C (%)</td><td>0 (%)</td><td>N (%)</td><td>S (%)</td><td>F (%)</td></tr><tr><td>CP</td><td>63.84</td><td>36.16</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCP</td><td>63.72</td><td>35.00</td><td></td><td>1.28</td><td></td></tr><tr><td>SCP/GP</td><td>43.25</td><td>37.71</td><td>19.04</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCP/GP/Dex</td><td>49.96</td><td>33.27</td><td>15.34</td><td></td><td>1.43</td></tr></table></body></html>  \n\n材料表面的水接触角是验证表面改性成功与否的重要证据。改性前后样品表面的水接触角如Figure 2.10 所示。CP 的水接触角为 $65.2{\\pm}0.69^{\\circ}$ 。经磺化处理后，SCP 的水接触角增加到 $93.1{\\pm}2.09^{\\circ}$ 。SCP 表现为疏水性，这是 SCP 表面的粗糙多孔结构造成的。以前的研究表明，增加表面粗糙度会增加材料表面积，从而增加材料表面对液体的亲和力。所以，材料表面粗糙度增加会使亲水表面更加亲水，使疏水表面更加疏水[263, 264]。未经过任何处理的 CFRPEEK（CP）具有较大的水接触角，并且具有疏水性和生物惰性。同时，浓硫酸处理后 CFRPEEK 表面粗糙度显著增加，这导致了 SCP 的水接触角增大。经过紫外接枝处理后，SCP/GP 和SCP/GP/Dex 的水接触角显著降低，分别为 $53.7{\\pm}1.84^{\\circ}$ 和 $48.8{\\pm}0.45^{\\circ}$ ，这表明接枝在CFRPEEK 表面的复合水凝胶具有显著的亲水性。  \n\n![](images/38dc75dfbd9a360ffaa9456280b1f6916fcc00120eb0b99b4bd1c245079adf70.jpg)  \nFigure 2.10 Water contact angles of CP, SCP, SCP/GP and SCP/GP/Dex ( $^{*}p<0.05)$ .  \n\n紫外辐照接枝的原理如Figure 2.11 所示，PEEK 由交替的芳醚和二苯甲酮组成。在紫外线(UV)照射下，二苯甲酮单元可以产生自由基，并引发 GelMA 和AM的烯基双键的聚合反应，从而与 PEEK 形成 C-C 共价键生成接枝共聚物，表现为在 CFRPEEK 表面形成 GelMA/PAAM 复合水凝胶层。GelMA/PAAM 水凝胶层进一步作为药物载体，通过氢键吸附骨诱导药物地塞米松（Dex）。  \n\n![](images/9767efb1c564934f364a86ae769f2a5ad734481636e8e7212732517b571f5f7b.jpg)  \nFigure 2.11 Schematic illustration of the free radical polymerization on the surface of CFRPEEK.",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 53,
        "chunk": "# 2.3.3 机械性能  \n\nTable 2.7 为经过磺化处理和紫外接枝的不同样品的机械性能。与 CP 相比，SCP 的拉伸和弯曲性能略有降低，这是因为 CFRPEEK 表面磺化处理形成的多孔结构削弱了基底的机械性能[265]。SCP/GP 的力学性能与 SCP 的力学性能没有显著性差异，这表明复合水凝胶对 SCP 力学性能的影响有限。综上所述，复合水凝胶改性的CFRPEEK 仍具有优异的力学性能。  \n\nTable 2.7 Mechanical properties of different samples.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>Sample</td><td>Tensile Strength (MPa)</td><td>Tensile Modulus (GPa)</td><td>Flexural Strength (MPa)</td><td>Flexural Modulus (GPa)</td></tr><tr><td>CP</td><td>323.36 ± 22.79</td><td>34.83 ± 0.73</td><td>416.06 ± 13.92</td><td>21.15 ± 1.00</td></tr><tr><td>SCP</td><td>303.47 ± 12.24</td><td>29.77 ± 1.75</td><td>380.80 ± 14.74</td><td>18.91 ± 1.80</td></tr><tr><td>SCP/GP</td><td>317.72 ± 9.41</td><td>31.19 ± 1.39</td><td>385.38 ± 17.65</td><td>19.30 ± 0.66</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 54,
        "chunk": "# 2.3.4 药物（Dex）缓释行为  \n\n为了进一步增强 CFRPEK 复合材料的成骨分化能力，将成骨诱导药物地塞米松（Dex）负载到 GelMA/PAAM 复合水凝胶上。Figure 2.12 是 SCP/GP/Dex 在  \n\n21 天内的 Dex 释放效率图。结果表明，SCP/GP/Dex 在 21 天内释放的 Dex 效率为 $53\\%$ ，这说明GelMA/PAAM 复合水凝胶修饰 CFRPEEK 具有长期持续的药物释放特性，这归因于复合水凝胶中的 GelMA 含有丰富的极性基团，如-COOH 和$\\mathrm{-NH}_{2}$ ，可以与 Dex 形成氢键，这能够有效的固定大量的药物并控制药物释放。同时，CFRPEEK 表面上的 GelMA/PAAM 复合水凝胶的 3D 网络结构进一步阻碍了药物的快速扩散[259]。  \n\n![](images/6783de84485f121088aa69bc9661dcb1d5d0a522ae3ab818b6504ac466a1bcd0.jpg)  \nFigure 2.12 Dex release profile of SCP/GP/Dex over 21 d.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 55,
        "chunk": "# 2.3.5 体外矿化性能  \n\n材料表面形成骨状磷灰石表明该材料与骨组织之间具有良好的结合能力，这可以增强材料的骨传导性能[260]。Figure 2.13a 是不同样品在 SBF 中浸泡 14 天后表面形貌的 SEM。在 CP 和 SCP 表面上可以观察到圆形结节，在 SCP/GP 上则观察到明显的球形颗粒，SCP/GP/Dex 表面几乎完全被球形颗粒覆盖。先前的研究表明，由于GelMA 的羧基与钙离子之间可以形成化学键，GelMA 可以作为矿物沉积的成核剂或骨状磷灰石沉积的成核位点[266, 267]。因此，GelMA/PAAM 复合水凝胶层增强了 CFRPEEK 的骨状磷灰石的形成能力。Figure 2.13b 和 c 分别是SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 的 EDS 谱图。经 EDS 证实，在 SCP/GP 和 SCP/GP/Dex上观察到沉积物含有Ca 和P 元素， $\\mathrm{Ca/P}$ 摩尔比为 2.21，高于 SCP/GP 的 2.07，这是由于 SCP/GP/Dex 中的地塞米松促进了体外生物矿化。这些结果表明，由GelMA/PAAM/Dex 复合凝胶层修饰的 CFRPEEK 具有出色的体外生物活性和体外骨结合能力。  \n\n![](images/e63c2df15580db39fd7005311c7fc53fe8af4db52f7ea3cda213beaddbb48806.jpg)  \nFigure 2.13 (a) SEM images of different specimens after soaking in SBF for $14{\\mathrm{d}}$ , and EDS spectra of (b) SCP/GP and (c) SCP/GP/Dex soaked in SBF for $\\boldsymbol{14\\mathrm{d}}$ .",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 56,
        "chunk": "# 2.3.6 体外 BMSC 细胞相容性  \n\n细胞增殖能力反映了材料的 BMSC 细胞相容性。Figure 2.14 是细胞与改性前后的 CFRPEEK 样品共培养 1、4 和 7 天后的细胞增殖图。在 7 天时，SCP 的细胞增殖情况最差，这是由于 SCP 的疏水表面不利于细胞增殖。SCP/GP 和SCP/GP/Dex 的细胞增殖相对于 SCP 分别提高了 $42.11\\%$ 和 $39.82\\%$ ，这是因为GelMA 水凝胶的胶原样骨架能够促进细胞粘附、增殖和分化[268, 269]。SCP/GP/Dex的细胞增殖在 4 天和 7 天时略低于 SCP/GP，这是因为从 SCP/GP/Dex 释放的地塞米松诱导BMSC 细胞分化为成熟的成骨细胞，而成熟的成骨细胞不再增殖[270,271]。综上所述，复合水凝胶修饰 CFRPEEK 可以促进BMSC 细胞的增殖。  \n\n![](images/cf4e10af74381ddbb3c858f60af36af4e0a1518ff72da0a5d0d6946b190447e5.jpg)  \nFigure 2.14 Cell proliferation after culturing for 1, 4 and 7 days on different samples  \n\n$$\n(^{\\ast}p<0.05).\n$$  \n\n不同 CFRPEEK 与 BMSC 细胞共培养 1 天和 4 天后，通过 SEM 观察 BMSC细胞的形态。如Figure 2.15 所示，培养 1 天后，在CP 和SCP 上发现梭形细胞，这说明 CP 和 SCP 的细胞粘附性差。在 SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 上观察到更大的细胞扩散区域，而且在这两个样品上都观察到更多的细胞丝状伪足，这表明GelMA/PAAM 复合水凝胶层促进了细胞扩散和粘附。培养 4 天后，细胞在所有样品上都进行了扩散，特别是在 SCP/GP 和SCP/GP/Dex 上，扩散的细胞几乎覆盖了整个表面。这些结果表明，复合水凝胶层增强了 CFRPEEK 表面的细胞相容性，为细胞生长和粘附提供了合适的环境。  \n\n![](images/00dd1d65282487c5c5d862bdfa6e75d2384bccc54271488af98cd2314d326d03.jpg)  \nFigure 2.15 SEM images demonstrated the morphologies of BMSCs adhered to different materials after incubation for 1 and 4 days. Scale bars ${=}50\\upmu\\mathrm{m}$ and $10\\upmu\\mathrm{m}$ .  \n\n为了进一步探索 BMSC 的细胞粘附和扩散行为，细胞骨架被罗丹明标记的鬼笔环肽染成红色，细胞核被 DAPI 染成蓝色。Figure 2.16 是培养 7 天后不同CFRPEEK 样品上的细胞形态。与 CP 和 SCP 相比，SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 表面上的 BMSC 细胞具有许多板状伪足，这些伪足相互连接和重叠并产生了更成熟的F-肌动蛋白，这表明复合水凝胶修饰 CFRPEEK 有利于细胞粘附和扩散。综上所述，CFRPEEK 表面的复合水凝胶层具有优异的细胞相容性。  \n\n![](images/7dcd5c4d8c678f58fa231fb0c9599fec9a485cfee4657e5bed99f60412918760.jpg)  \nFigure 2.16 CLSM of BMSCs incubated for 7 days on different substrates. Scale bars",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 57,
        "chunk": "# 2.3.7 体外 BMSC 成骨分化潜能  \n\nALP 活性、钙沉积和成骨相关基因表达可以用来衡量 GelMA/PAAM/Dex 修饰CFRPEEK 的成骨分化能力。ALP 是关键的早期成骨标志物，它参与了细胞成骨分化过程并影响细胞矿化[241, 272]。如 Figure 2.17a 所示，SCP 的 ALP 活性低于CP，这归因于 SCP 的疏水表面阻碍了细胞增殖，从而降低了 ALP 活性[273, 274]。培养 14 天后，SCP/GP/Dex 的 ALP 活性相对于 CP 和 SCP 分别提高了 $35.43\\%$ 和$28.29\\%$ ，与 ALP 染色结果一致（Figure 2.17b），SCP/GP/Dex 的 ALP 染色呈紫黑色，比其他三组要深。ALP 活性结果与细胞增殖和粘附测定的结果一致。综上所述，随着更多的 BMSC 细胞粘附在 SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 上，ALP 活性增加，这是因为GelMA结构中的RGD序列是一种细胞识别位点，它能够促使BMSC细胞进入早期分化阶段，并通过改善细胞粘附和增殖来提高 ALP 活性[275]。  \n\n![](images/1b06458028ca6415f344297f9065965c6db43b1ae5463c5de05292c75ed96212.jpg)  \nFigure 2.17 (a) Alkaline phosphatase (ALP) activity of different samples after 7 and 14 days of osteogenic induction ( $^{*}p<0.05)$ . (b) ALP staining on different samples.  \n\n钙沉积是晚期成骨标志物，通过 BMSC 细胞在不同 CFRPEEK 样品上的钙沉积进一步探究了 GelMA/PAAM/Dex 复合水凝胶层的成骨能力。如 Figure 2.18所示，在 SCP/GP/Dex 表面检测到更多鲜红色的钙结节。定量检测结果也表明SCP/GP/Dex 上的细胞比其他三组细胞产生更多的钙结节，并且 SCP/GP/Dex 上产生的钙结节量相对于 SCP/GP 提高了 $53.56\\%$ ，这是由于从 GelMA/PAAM/Dex复合水凝胶层释放的 Dex 促进了成骨晚期分化[276]。综上所述，ALP 和 ARS 检测表明，GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 具有优异的体外骨诱导能力。  \n\n![](images/abef037d6b2289747a2a8e76ef127b447888e18677b4329795316869a08630ef.jpg)  \nFigure 2.18 (a) Calcium deposition after culture of BMSCs on different CFRPEEK substrates for 21 d ( $^{*}p<0.05)$ . (b) Alizarin red staining (ARS) on different samples.  \n\n为了进一步了解 CFRPEEK 表面修饰的 GelMA/PAAM/Dex 复合水凝胶层对成骨的积极作用，在不同样品与 BMSC 共培养 14 天后，通过 RT-PCR 检测了BMSC 细胞成骨相关基因的表达情况，包括早期成骨分化标志物 ALP 和细胞外基质标志物 Col-Ⅰ。如 Figure 2.19 所示，BMSC 在 CP 和 SCP 上的两个成骨相关基因的表达水平没有显著差异，而 SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 大大加速 BMSC 细胞向成骨细胞的分化。SCP/GP/Dex 的成骨相关基因表达水平最高，这表明GelMA/PAAM 复合水凝胶和 Dex 的协同作用对成骨有很好的促进作用。  \n\n![](images/11fe9820181d4c7416a00b2cbcda04113497f3d287cad1308f8cec292ae3ed36.jpg)  \nFigure 2.19 Quantification by RT-PCR of (a) ALP and (b) Col-Ⅰ expression by BMSCs cultured on different samples for $\\boldsymbol{14\\mathrm{d}}$ ( $^{*}p<0.05)$ .",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 58,
        "chunk": "# 2.3.8 体内骨整合性能  \n\nCFRPEEK 复合材料具有高强度、低密度、近皮质骨模量和材料各向同性等优点，在骨科植入物方面具有广阔的应用前景[237]。为了提高 CFRPEEK 植入物的 生 物 相 容 性 和 骨 整 合 能 力 ， 在 CFRPEEK 的 多 孔 表 面 上 制 备 了GelMA/PAAM/Dex 复合水凝胶层。体外 BMSC 细胞实验证实 GelMA/PAAM/Dex复合水凝胶增强了 CFRPEEK 的生物相容性和成骨分化能力。研究GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 的体内骨整合特性是 CFRPEEK 成为骨科人工植入物的关键指标。为探究功能性 CFRPEEK 植入物的体内骨整合和骨缺损重塑能力，建立了大鼠颅骨缺损模型。将不同的 CFRPEEK 样品随机植入到颅骨缺损中，在饲养 4 或 12 周后，取出带有植入物的大鼠颅骨，并进行骨整合和骨缺损重塑能力的分析。  \n\n植入4 周和12 周后，利用 Micro-CT 扫描了颅骨标本，观察植入物周围新生骨的细节和变化。通过软件重建了颅骨缺损处的 2D/3D 图像，并得到了植入物周围新骨的组织参数[239, 277]。如 Figure 2.20a 所示，与纯 PEEK 类似，CFRPEEK植入物在 Micro-CT 中没有产生伪影，这为跟踪 CFRPEEK 植入物周围骨组织的愈合过程提供了有利的条件[175]。在第 4 周和第 12 周，CP 周围的新生骨均多于SCP，SCP/GP 和 SCP/GP/Dex 的新生骨多于其他两组，并且 SCP/GP/Dex 生成的新骨组织最厚，这表明功能性 CFRPEEK 植入物具有优异的体内骨整合和成骨固定能力。Figure 2.20b-d 依次是新生骨的骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）的结果。在第 4 周和第 12 周，SCP/GP/Dex 的BV/TV、Tb.Th 和 Tb.N 都是最高的。在第 12 周，SCP/GP/Dex 的 BV/TV、Tb.Th和 Tb.N 相比于 SCP 分别提高了 $105.90\\%$ 、 $57.99\\%$ 和 $86.82\\%$ ，这表明GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 明显增强了新骨的生成，上述结果与体外BMSC 细胞实验探究结果一致。有研究表明，Dex 能够促进骨骼相关蛋白质的分泌和钙化骨的形成[239]。SCP/GP/Dex 具有长期持续的药物释放性能，从SCP/GP/Dex 中释放的Dex 会促进成骨细胞的增殖，最终促进植入物周围新骨的生成，这些结果表明 GelMA/PAAM/Dex 复合水凝胶修饰 CFRPEEK 增强了骨缺损周围的骨生成和骨整合。  \n\n![](images/fd4b0c24f4ad431c1bba481e9eba218bfc8b24c4ca38623263cacbcfc794eafd.jpg)  \nFigure 2.20 (a) Micro-CT 2D and 3D reconstruction images after 4 and 12 weeks  \n\nimplantion (Red dotted frame denoted the bone defect site). Quantitative analysis of Micro-CT data including (b) BV/TV, (c) Tb.N, and (d) Tb.Th ( $^{*}p<0.05)$ at 4 and 12 weeks.  \n\n为了进一步分析不同CFRPEEK 植入物的骨整合能力，对颅骨标本进行了组织学染色（H & E，Masson 和 Van Gieson 染色）。Figure 2.21 是不同 CFRPEEK周围新骨的组织学染色结果，棕色区域（PEEK 基质）和黑点（长碳纤维）的混合区域代表不同 CFRPEEK 植入物。在植入 4 周和 12 周后，不同的 CFRPEEK植入物都直接与新生成的骨结合而没有发生移位，植入物周围的组织没有产生炎症或坏死，这表明 CFRPEEK 植入物是非毒性和术后长期生物相容性的。在Masson 和Van Gieson 染色结果观察到不同的植入物周围有一层类骨基质（黑色箭头）[278]。SCP/GP/Dex 植入物在植入 4 周后形成了比其他三组更多的新成熟骨（红色箭头）。在H & E 染色图像中也观察到在 SCP/GP/Dex 植入物周围生成了更大面积的新骨。植入12 周后，不同植入物周围形成的新骨量更多。SCP/GP/Dex植入物周围的新成熟骨牢固附着在植入物界面，表现出优异的骨结合性能。GelMA/PAAM/Dex 复合水凝胶能够加速骨沉积，进一步增强 CFRPEEK 植入物表面的骨化，从而提高CFRPEEK 植入物的骨整合性能。上述体内探究结果表明，GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 植入物具有良好的生物相容性和优越的骨结合能力，为其作为骨科植入物的临床应用提供了参考。体内和体外一致的研究结果表明，GelMA/PAAM/Dex 复合水凝胶明显的改善了CFRPEEK 的骨整合性能。  \n\n![](images/b97c01f825c19f85ad5040bb1f9b0d4a1330ebb0ce982612b87f781abc8a72c1.jpg)  \n\n![](images/85758b0ebe5e01f70dfe06d2f74ce2925ca5340893109db4ad95c67de4c74293.jpg)  \nFigure 2.21 H & E, Masson and Van Gieson staining of the calvarial defect regions after treatment with CP, SCP, SCP/GP and SCP/GP/Dex for 4 and 12 weeks. [M, Materials; NB, new bone (red arrows); OM, osteoid matrix (black arrows)]. Scale bars  \n\n考虑到生物安全问题，在植入 12 周后，对实验大鼠的心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏进行H & E 染色，检测植入物在生物体内的毒性，以探究不同CFRPEEK植入物的体内生物毒性。如Figure 2.22 所示，植入12 周后实验大鼠没有明显的器官损伤或炎症病变，表明功能性 CFRPEEK 作为骨科植入物没有明显的生物毒性。  \n\n![](images/8418355e66efb1ae791bd2ed1a63c03a63fe42a4998843783d1db4067f6c85dc.jpg)  \nFigure 2.22 H & E staining of heart, liver, spleen, lung, and kidney after 12 weeks of treatments. Scale bar $=40\\upmu\\mathrm{m}$ .",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 59,
        "chunk": "# 2.4 本章小结  \n\n设计并制备了负载Dex 的复合凝胶修饰 CFRPEEK 植入物。  \n\n（1）采用磺化处理和紫外接枝的表面改性方法将负载 Dex 的GelMA/PAAM  \n\n修饰到 CFRPEEK 植入物的表面上，构建出了具有三维凝胶网络的表面的CFRPEEK 植入物。通过 SEM 图像观察到 CFRPEEK 表面上的复合水凝胶网络结构，厚度为 $50~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 。  \n\n（2）GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 的表面水接触角为 $48.8\\pm0.45^{\\circ}$ ，具有优异的亲水性。  \n\n（3）GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 在 21 天内的 Dex 释放效率为 $53\\%$ ，缓慢长期的Dex 释放能力有利于 BMSC 细胞的成骨分化。它在 SBF 中能够形成更多的骨状磷灰石结节，具有优异的体外矿化能力。  \n\n（4）体外细胞实验证实了 GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 具有良好的体外生物相容性和优异的体外成骨性能，其中，SCP/GP/Dex 上的 BMSC 细胞增殖相较于SCP 上的提高了 $42.11\\%$ ，ALP 活性提高了 $28.29\\%$ 。  \n\n（5）体内大鼠的颅骨缺损实验表明，SCP/GP/Dex 周围的新生骨的骨小梁数目相较于 SCP 提高了 $86.82\\%$ ，这说明 GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 具有优异的体内成骨性能，能够促进骨缺损的愈合。  \n\n综上所述，本研究团队制备的功能性 CFRPEEK 植入物具有作为骨科植入物实现临床应用的潜力。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 60,
        "chunk": "# 第 3 章 GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 的制备及其成血管/成骨能力的研究",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 61,
        "chunk": "# 3.1 前言  \n\n骨组织工程是一种治疗超过临界骨缺损的新型替代方法，它通过植入与原始骨组织特征相匹配的人工植入物来诱导骨再生。在前面的研究中，虽然制备的负载 Dex 的复合水凝胶修饰 CFRPEEK 植入物能够增强 CFRPEEK 的生物相容性和成骨性能，但是骨骼是一种高度血管化的组织，在骨缺损愈合过程中也伴随着血管的重塑。如果在骨愈合过程中血管生成不及时，氧气和营养物质的供给就会不足，从而导致后期的成骨能力差。除了出色的成骨特性外，促进新血管形成对于骨科植入物的成骨和长期固定至关重要。开发具有良好血管化和成骨性能的多功能CFRPEEK 植入物对于 CFRPEEK 的临床应用至关重要。  \n\n纳米羟基磷灰石（HAP）具有出色的骨诱导、离子交换和生物相容性，经常用于促进植入物的成骨性能[279]。较差的力学性能限制了纳米羟基磷灰石在骨组织工程中的应用[280]。氧化石墨烯（GO）是一种 2D 纳米材料。氧化石墨烯（GO）因其独特的结构和优异的机械性能，在生物医学应用中发挥着越来越重要的作用[281]，特别是在骨组织工程中引起了极大的关注。GO 在低浓度下对生物体没有明显的毒性作用, 具有良好的生物相容性，能够加速细胞贴壁和扩散来促进细胞生长。GO 具有可降解性，且降解产物无明显毒性。GO 还可以大大提高 HAP 的成核和结晶能力[280, 282]。GO 表面的含氧官能团（如-COOH、-OH 和-O-）可以促进纳米羟基磷灰石的形成和均匀分散[283-286]。一些研究人员致力于研究 GO-HAP 纳米复合材料。目前的几项研究表明，低浓度的 GO 可以通过调节细胞中活性氮（RNS）和活性氧（ROS）的产生来刺激骨再生过程中的血管生成[278, 287-289]。  \n\n在紫外线照射下，CFRPEEK 中PEEK 主链上的二苯甲酮单元的碳氧双键会断裂一个键而形成自由基，它能引发活性单体或聚合物接枝到 CFRPEEK 植入物表面，从而形成三维（3D）凝胶网络[243-245]。冷冻凝胶是一种由凝胶前体溶液在零下温度形成的3D 海绵状大孔水凝胶，其相互连接的大孔结构和机械稳定性促进了内皮细胞向内生长和迁移，从而形成血管网络[290]。甲基丙烯酰化明胶  \n\n（GelMA）是一种可生物降解的明胶衍生物。GelMA 具有出色的的生物学特性和细胞相容性，可以显着刺激骨细胞分化并加速骨骼再生[291, 292]。聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）是一种具有可生物降解性和低细胞毒性的聚合物，通常用于制备凝胶支架。例如，Singh 等[293]开发了一种 PEGEDA/GelMA 冷冻凝胶用以模拟体内细胞外基质。  \n\n基于上述考虑，在本章工作中，首先利用原位键合法制备了 GO-HAP 纳米复合材料，然后通过基于自由基光聚合的冷冻凝胶技术在惰性磺化 CFRPEEK 植入物表面上制备了多功能 3D 海绵状大孔 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶层来增强CFRPEEK 的成血管和成骨能力。GO-HAP 纳米复合材料中 GO 的添加促进了HAP 在冷冻凝胶层的分散，细胞的增殖、粘附和扩散。同时，GO 与冷冻凝胶层的 3D 海绵状大孔结构协同增强了 CFRPEEK 植入物的血管生成能力。GO-HAP 纳米复合材料中的 HAP 提高了 CFRPEEK 植入物的成骨能力。该改性CFRPEEK 植入物具有一系列特性，包括 3D 海绵状大孔结构，出色的表面润湿性，良好的骨状磷灰石形成能力和钙离子的受控释放等。通过一系列表面表征检测分析了冷冻凝胶层对CFRPEEK 植入物理化性能的影响；通过体外细胞实验探究了 GO-HAP 冷冻凝胶表面改性的 CFRPEEK 植入物的生物相容性、成血管能力和成骨能力；通过大鼠颅骨缺损体内植入实验分析了该改性 CFRPEEK 植入物的血管化和骨整合性能。Figure 3.1 为本研究的技术路线示意图。  \n\n![](images/201c6289dc2e6b6247b529096517457dd687cd5df0e0503ee2d609915d285831.jpg)  \nFigure 3.1 (a) The modification procedures on the sulfonated CFRPEEK surface and (b) its biological functions: angiogenesis and osteogenesis.",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 62,
        "chunk": "# 3.2 实验部分",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 63,
        "chunk": "# 3.2.1 实验材料与仪器",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 64,
        "chunk": "# 1. 实验材料  \n\nTable 3.1 The materials and reagents.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>名称</td><td>缩写</td><td>产品规格</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>聚乙二醇二丙烯</td><td>PEDGA,</td><td>AR</td><td>上海易恩化学技术有限公司</td></tr><tr><td>酸酯</td><td>MW: 700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>CaCl2</td><td>AR</td><td>北京化工厂</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Na2HPO4</td><td>AR</td><td>北京化工厂</td></tr><tr><td>氧化石墨烯</td><td>GO</td><td></td><td>深圳市图灵进化科技有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n<html><body><table><tr><td>名称 缩写</td><td>产品规格</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>氢氧化钠 NaOH</td><td>AR</td><td>北京化工厂</td></tr><tr><td>24孔 Transwell 小</td><td>3422</td><td>美国康宁公司</td></tr><tr><td>室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>基质胶</td><td>无酚红</td><td>BD 生物科学技术有限公司</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>AR</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr></table></body></html>\n\n涉及的其它实验材料与第二章相同，详见 2.2.1 的Table 2.1。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 65,
        "chunk": "# 2. 实验仪器  \n\nTable 3.2 The experimental apparatus.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>型号 生产厂家</td></tr><tr><td>高分辨率激光拉曼光谱仪</td><td>LabRAM HR Horiba</td></tr><tr><td></td><td>Evolution</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>HT7800 (TEM) 日立株式会社</td></tr><tr><td>电感耦合等离子体发射光谱仪</td><td>Agilent 725 (ICP- 安捷伦科技（中国)有限公</td></tr><tr><td></td><td>OES) 司</td></tr><tr><td>X射线衍射仪 PosiTestAT-M附着力测试仪 ATM50A</td><td>Empyrean (XRD) 荷兰帕纳科公司 美国DeFelsko公司</td></tr></table></body></html>\n\n涉及的其它实验仪器与第二章相同，详见 2.2.1 的Table 2.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 66,
        "chunk": "# 3.2.2 氧化石墨烯-羟基磷灰石（GO-HAP）纳米复合材料的制备与表征  \n\n通过GO 中丰富的含氧官能团（-COOH、-OH 和-O-）与 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 键合制备GO-HAP 纳米复合材料[280, 282]。Figure 3.2 是 GO-HAP 制备路线图。原位键合法的原理是 GO 上丰富的含氧官能团（-COOH、-OH 和-O-）可以与 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 形成有效的成核位点，随后 $\\mathrm{PO}_{4}{}^{3.}$ -的加入会在成核位点上形成纳米羟基磷灰石。以制备 $150\\mathrm{mg}$ GO-HAP 为例，GO： $\\mathrm{HAP{=}1{:}2(G O{:}33\\%)}$ ），具体步骤如下：  \n\n先把 $185\\mathrm{mg}$ 无水氯化钙（ $\\mathrm{CaCl}_{2}$ ）溶于 $15\\mathrm{mL}$ 去离子水中；再配制 $13.2\\mathrm{mL}$ 浓度为 $3.8\\mathrm{mg/mLC}$ O 悬液，超声处理 $30\\mathrm{min}$ ；将上述GO 悬液缓慢滴加到 $\\mathrm{CaCl}_{2}$ 溶液中，磁力搅拌 $30~\\mathrm{min}$ ；配制 $1.7~\\mathrm{mL}0.6~\\mathrm{M}$ 的 $\\mathrm{\\DeltaNa_{2}H P O_{4}}$ 溶液，并缓慢滴加到上述混合液中；用 $1\\ \\mathrm{M\\NaOH}$ 溶液调节 $\\mathsf{p H}$ 在 9\\~11 之间， $45^{\\circ}\\mathrm{C}$ 水浴搅拌 $12\\mathrm{~h~}$ ；  \n\n最后，将 GO-HAP 沉淀物用去离子水洗涤， $8000~\\mathrm{rpm}$ 离心 3 次， $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ 真空烘箱干燥 $24\\mathrm{h}$ ，备用。  \n\n![](images/f42c37407518b02b877754ae9851e047c7f38a0e4cb75f6428915c81db4dd7d3.jpg)  \nFigure 3.2 Schematic diagram of preparation of GO-HAP nanocomposites.  \n\n利用 XRD 和 ATR-FTIR 检测 GO-HAP 的晶体结构和组成；使用高分辨率激光拉曼光谱仪分析 GO-HAP 的结构；采用 TEM 和 SEM 分析 GO-HAP 形貌，使用 EDS 检测 GO-HAP 的元素组成。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 67,
        "chunk": "# 3.2.3 磺化 CFRPEEK 复合材料的制备  \n\n磺化CFRPEEK 复合材料的制备步骤具体如下：  \n\n（1）（2）（3）（4）与第二章 2.2.2 的实验步骤相同；（5）在室温下，CFRPEEK 复合材料在浓硫酸中磁力搅拌 $3\\mathrm{min}$ ，以获得均匀的多孔表面；（6）反应后的 CFRPEEK 复合材料依次浸入超纯水和丙酮中，并在超声波清洗器中清洗；（7）将得到的磺化CFRPEEK 复合材料在真空干燥箱中 $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ 干燥24 小时，以备后续使用；（8）尺寸为 $\\Phi8{\\times}1.5~\\mathrm{mm}$ 的磺化 CFRPEEK 用于表面表征和体外细胞实验，尺寸为 $\\Phi5{\\times}1.5\\ \\mathrm{mm}$ 的磺化 CFRPEEK 用于动物体内实验。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 68,
        "chunk": "# 3.2.4 GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 的制备  \n\n（1）GelMA/PEGDA/GO-HAP 凝胶前体液的制备  \n\n采用与第二章相同的方法制备 GelMA，详见 2.2.3 甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的制备与表征。  \n\n避光条件下，按 $10{:}5\\mathrm{wt\\%}$ 配制 GelMA/PEGDA 溶液；将 $0.5\\mathrm{mg/mL}$ GO-HAP悬液超声分散1 小时，然后以 $25,50,100(\\upmu\\mathrm{g/mL})$ ）的浓度添加到 GelMA/PEGDA溶液中；将混合溶液 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 磁力搅拌 8 小时，得到不同浓度的 GelMA/PEGDA/GO-HAP 凝胶前体液。Figure 3.3 是添加不同浓度 GO-HAP 的 GelMA/PEGDA 凝胶前体液的图像，可见 GelMA/PEGDA 溶液（a）是透明无色的，GelMA/PEGDA/GO-HAP 凝胶前体液（b-d）为褐色。  \n\n![](images/3bdc64a9ea199b3356f95d5cdcaf2d6af95d5aded29edee835d2f75ce5a15610.jpg)  \nFigure 3.3 Gel precursors of GelMA/PEGDA with different concentrations of GOHAP: (a) $0\\upmu\\mathrm{g/mL}$ , (b) $25\\upmu\\mathrm{g/mL}$ , (c) $50~\\upmu\\mathrm{g/mL}$ , (d) $100~\\mathrm{\\upmug/mL}$ .  \n\n（2）GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 的制备  \n\n避光条件下，将 3.2.3 制备的磺化 CFRPEEK 按 $60~{\\upmu\\mathrm{L}}/{\\upmathrm{c m}}^{2}$ 的比例浸没到GelMA/PEGDA/GO-HAP 凝胶前体液中；静置 10-15 分钟，让凝胶前体液均匀覆盖在磺化CFRPEEK 表面；浸泡在前体液中的磺化CFRPEEK 先 $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ 冷藏1 小时，再- ${\\bf\\nabla}\\cdot20^{\\circ}\\mathrm{C}$ 冷冻 12 小时；冷冻后，将磺化 CFRPEEK 置于波长 $365~\\mathrm{nm}$ 、光强 10$\\mathrm{mW}/\\mathrm{cm}^{2}$ 的紫外灯下 15 分钟；光照后，将改性的磺化 CFRPEEK 浸入蒸馏水中，以去除未反应的前体液，得到GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰CFRPEEK。  \n\n各组CFRPEEK 样品用如下缩写表示：  \n\nSCP：磺化 CFRPEEK；  \n\nGP10-5：GelMA/PEGDA 修饰的磺化 CFRPEEK；  \n\nGHX（ $X=25$ ，50 和 100）：GelMA/PEGDA/GO-HAP 修饰的磺化 CFRPEEK，$\\mathrm{\\DeltaX\\upmug/mL}$ 代表 GO-HAP 的浓度。  \n\n通过SEM 对每组样品的表面和截面形貌进行表征； ATR-FTIR 和XPS 用于表征每组样品表面的化学构成；采用静态接触角测量仪检测每组样品的水接触角，每个样品测量3 个不同的区域，并且每组样品重复测量 2 次。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 69,
        "chunk": "# 3.2.5 冷冻凝胶层的附着力测试  \n\n根据 ASTM D4541-02，使用 PosiTest AT-M 附着力测试仪采用拉出法测试了  \n\n冷冻凝胶层的附着力。Figure 3.4a 是拉出法的实验装置示意图。具体如下：  \n\n（1）将锭子用环氧胶垂直粘在尺寸为 $50\\mathrm{mm}{\\times}50\\mathrm{mm}{\\times}1.5\\mathrm{mm}$ 的 $\\mathbf{GP}_{10-5}$ 样品上，静置24 小时等待环氧胶完全干透（Figure 3.4b）；  \n\n（2）沿着锭子的边缘用切割器切划冷冻凝胶层，清除切划过程中产生的碎屑（Figure 3.4c）；  \n\n（3）将附着力测试仪的套筒套在锭子上，然后打开仪器进行测试；  \n\n（4）测试完成后，观察锭子和被测表面的状况并记录附着力。  \n\n![](images/011ec5124f603bb940b4a92c6e1cf059c11e771d7dc74e012750d0ef3d39ca27.jpg)  \n\nFigure 3.4 (a) Diagram of the experimental device of the pull-off method. (b) Image of $\\mathrm{GP}_{10-5}$ after adhering the dolly with epoxy glue. (c) Image of $\\mathrm{GP}_{10-5}$ after cutting by the cutter.",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 70,
        "chunk": "# $3.2.6\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放行为  \n\n将 $\\mathrm{GH}_{25}$ ， $\\mathrm{GH}_{50}$ 和 $\\mathrm{{GH}_{100}}$ 分别浸泡在 2 mL PBS 中，并在 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 恒温摇床上以$100\\mathrm{rpm}$ 匀速振荡；在规定的时间点，收集含有释放 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的PBS 并加入等体积的新鲜 PBS；通过 ICP-OES 检测 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的浓度。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 71,
        "chunk": "# 3.2.7 体外矿化行为研究  \n\nSCP，GP10-5， $\\mathrm{GH}_{25}$ ， $\\mathrm{GH}_{50}$ 和 $\\mathrm{GH}_{100}$ 体外矿化研究的实验步骤与第二章相同，详见2.2.7 体外矿化行为研究。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 72,
        "chunk": "# 3.2.8 细胞实验",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 73,
        "chunk": "# 3.2.8.1 细胞的培养  \n\n采用大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）探究改性CFRPEEK 的成骨能力。大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的提取、培养与传代实验步骤与第二章相同，详  \n\n见2.2.8.1。利用购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心的人脐静脉内皮细胞（HUVEC），探究改性 CFRPEEK 的成血管能力。将 BMSC 和 HUVEC 接种到DMEM 完全培养基中，然后培养在 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 、 $5\\%$ CO2 的培养箱中。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 74,
        "chunk": "# 3.2.8.2 体外 BMSC 细胞相容性测试  \n\n1. CCK-8 试剂盒用于检测材料表面 BMSC 细胞的增殖情况，实验步骤与第  \n二章相同，详见2.2.8.2 的实验 1。2.通过扫描电镜观察BMSC 细胞在材料表面的生长情况，具体实验步骤与第  \n二章相同，详见2.2.8.2 的实验 2。3. BMSC 细胞在不同样品上的粘附与扩散用罗丹明标记的鬼笔环肽和 DAPI  \n染色法进行检测，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.2 的实验3。4. BMSC 细胞在不同样品上的迁移性能通过 Transwell 实验进行探究，具体  \n的实验步骤如下：（1）将处在对数生长期的第三代 BMSC 细胞用无血清培养基制成密度为  \n$5{\\times}10^{5}\\mathrm{cell/ml}$ 细胞悬液；（2）取细胞悬液 $100\\upmu\\mathrm{L}$ 加入 Transwell 小室；（3）将经过 Cobalt 60 灭菌（15KGy， $20\\mathrm{h}$ ）的样品放入 24 孔板下室中，用  \nPBS 清洗一遍后，每孔滴加 $600~\\upmu\\mathrm{L}$ 含 $1\\%$ FBS 的 DMEM 培养基；（3）将接种 BMSC 细胞的 Transwell 小室插入不同样品相应的孔中，培养  \n$24\\mathrm{h}$ ；（4）取出小室，吸出培养基，PBS 洗涤两次， $4\\%$ 多聚甲醛固定 30 分钟，  \n适当风干小室；（5） $0.1\\%$ 结晶紫染色20 分钟，擦去小室上层未迁移细胞，PBS 清洗三遍；（6）随机选择6 个视野，在显微镜下观察和计数细胞。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 75,
        "chunk": "# 3.2.8.3 体外成骨性能测试  \n\n1. 通过碱性磷酸酶（ALP）活性定量和染色实验检测 BMSC 细胞在不同样品表面的早期成骨分化情况，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.3 的实验1。  \n\n2. 通过茜素红（ARS）染色和定量分析检测 BMSC 细胞在不同样品表面的晚期成骨分化情况，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.3 的实验2。  \n\n3. 通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）探究BMSC 细胞在不同样品表面的成骨相关基因的表达情况，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.3 的实验3。其中RT-PCR 所需的成骨相关基因的引物对如 Table 3.3 所示。  \n\nTable 3.3 Primer pairs used in RT-PCR analysis.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>Genes</td><td>Sequence (5'-3')</td></tr><tr><td>BMP-2</td><td>F:ATTAGCAGGTCTTTGCACCA R:ACGCTTTTCTCGTTTGTGGA</td></tr><tr><td>Runx2</td><td>F: GGCAGCACGCTATTAAATCCAA</td></tr><tr><td></td><td>R:GACTCATCCATTCTGCCGCTA F: ATCGGAACAACCTGACTGACC</td></tr><tr><td rowspan=\"2\">ALP</td><td>R:CTGCCTCCTTCCACTAGCAA</td></tr><tr><td>F: ATGCCATCAAGGTCTACTGCAA</td></tr><tr><td rowspan=\"2\">COL-I</td><td>R: GAACCTTCGCTTCCATACTCG</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>F: TATGACTCTACCCACGGCAAG R:ATACTCAGCACCAGCATCACC</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 76,
        "chunk": "# 3.2.8.4 体外成血管性能测试  \n\n1. Cell Counting Kit（CCK-8）试剂盒检测 HUVEC 细胞在材料表面的增殖情况，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.2 的实验1。2. HUVEC 细胞在不同样品上的粘附与扩散用罗丹明标记的鬼笔环肽和DAPI 染色法进行检测，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.2 的实验3。3. HUVEC 细胞在不同样品上的迁移性能通过 Transwell 实验进行探究。具体的实验步骤与 BMSC 细胞的在不同样品上的迁移性能实验相同，详见 3.2.8.2的实验4。4. 利用基质胶 Matrigel 血管样网络结构形成来检测材料的成血管性能。具体操作方法如下：  \n\n（1）将经过 Cobalt 60 灭菌（15KGy， $20\\mathrm{h}$ ）的不同样品放入 24 孔板中，用PBS 清洗一遍后，每孔滴加 $1~\\mathrm{mL}$ 含 $1\\%$ FBS 的 DMEM 培养基， $24\\mathrm{~h~}$ 后收集培养基；  \n\n（2）使用上述收集的培养基将对数生长期的HUVEC 细胞制备成细胞悬液，密度为 $1{\\times}10^{5}\\mathrm{cell/ml}$ ；  \n\n（3）将基质胶Matrigel 均匀铺在24 孔板中，放置 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 培养箱凝聚；  \n（4）1 h 后，将 $1\\mathrm{mL}$ 上述 HUVEC 细胞悬液接种到基质胶表面；  \n（5）在 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 培养箱培养 6 h 后，用显微镜观察血管样网络结构的形成情况。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 77,
        "chunk": "# 3.2.9 大鼠颅骨缺损实验",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 78,
        "chunk": "# 3.2.9.1 建立大鼠颅骨缺损模型  \n\n采用大鼠颅骨缺损实验模型来探究 GO-HAP 冷冻凝胶修饰的 CFRPEEK 植入物的体内成骨能力。动物实验的所有程序均经吉林大学实验动物福利与伦理委员会批准（批准号：2021128），并按照相关机构指南和法律进行。大鼠颅骨缺损模型建立的具体操作步骤与第二章相同，详见 2.2.9.1 建立大鼠颅骨缺损模型。Figure 3.5 大鼠颅骨缺损模型建立的示意图。  \n\n![](images/819dbe7afc78f57c57144149760e264f7ed2ac1a37de878bc27f9d1a2874073b.jpg)  \nFigure 3.5 (a) Construction of the rat cranial defect model and (b) implantation of different implants",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 79,
        "chunk": "# 3.2.9.2 显微计算机断层扫描 （micro-CT）  \n\n具体操作步骤与第二章相同，详见2.2.9.2 显微计算机断层扫描 （micro-CT）。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 80,
        "chunk": "# 3.2.9.3 组织学探究",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 81,
        "chunk": "# 1. 颅骨硬组织切片及染色  \n\n具体操作步骤与第二章相同，详见 2.2.9.3 实验1。  \n\n2 内脏石蜡切片及染色  \n\n具体操作步骤与第二章相同，详见 2.2.9.3 实验2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 82,
        "chunk": "# 3.2.10 统计与分析  \n\n使用 IBM SPSS Statistics 22 软件对数据进行了统计学分析。统计显著性（ $(p$ $<0.05$ ）是通过Tukey 事后检验的单因素方差分析（ANOVA）获得的。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 83,
        "chunk": "# 3.3 结果与讨论",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 84,
        "chunk": "# 3.3.1 氧化石墨烯-羟基磷灰石（GO-HAP）的制备  \n\n采用原位键合法制备 GO-HAP 纳米复合材料，用以促进磺化 CFRPEEK 表面的成骨和血管生成能力。Figure 3.6a 为 GO-HAP 的 SEM 图像，Figure 3.6b 为GO-HAP 的 TEM 图像。在 GO-HAP 纳米复合材料中，长 $20{-}70~\\mathrm{nm}$ ，宽 $3{-}8~\\mathrm{nm}$ 的针棒状 HAP 均匀分布在 GO 纳米片上，这是因为 GO 表面的含氧官能团有利于纳米 HAP 的形成和均匀分散[294]，纳米 HAP 已被证明比微米 HAP 更有利于成骨[295-297]。  \n\n![](images/8945ddb3e0c16784e791ea307643c6bc2d2c3cbb844924acca2992ec3b877d8f.jpg)  \nFigure 3.6 (a) The SEM and (b) TEM images of the GO–HAP nanocomposite.  \n\nFigure 3.7a 是 GO-HAP 和 HAP 的 XRD 图谱，XRD 结果表明，原位键合法制备的 GO-HAP 的衍射峰与 HAP 的标准峰（JCPDS 09-0432）匹配良好，这说明 GO 的引入没有改变 HAP 的晶体结构。Figure 3.7b 是 GO-HAP 和 GO 的拉曼光谱，在GO-HAP 拉曼光谱的 $942\\mathrm{cm}^{-1}$ 处检测到HAP 峰的存在，这表明 GO-HAP 的合成是成功的。  \n\n![](images/323def8aabaae15e426731fff94d30f5c06cc502020e383ed74342b37f0cea60.jpg)  \nFigure 3.7 (a) XRD patterns of GO, HAP and the GO–HAP nanocomposite; and (b) Raman spectra of GO and the GO–HAP nanocomposite.",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 85,
        "chunk": "# 3.3.2 GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 的制备  \n\n为了探究不同比例的 GelMA/PEGDA 冷冻凝胶层对 CFRPEEK 表面形貌的影响，用不同比例的 GelMA/PEGDA（GelMA:PEGDA $\\scriptstyle\\operatorname{\\underline{{\\}}}10:0$ ，10:5 和 $15{:}5\\mathrm{wt}^{0}/\\$ ）来改性 CFRPEEK。Figure 3.8a 是不同比例的 GelMA/PEGDA 改性 CFRPEEK 表面 SEM 图像，不同比例的 GelMA/PEGDA 都在 CFRPEEK 表面形成了 3D 凝胶网络结构。如 Figure 3.8b 所示， $\\mathrm{GP}_{10-0,}\\mathrm{GP}_{10-5}$ 和 $\\mathbf{GP}_{15-5}$ 的孔径分别为 $88.34{\\pm}25.48\\$ $\\upmu\\mathrm{m},\\ 95.87{\\pm}28.98\\ \\upmu\\mathrm{m}$ 和 $53.04{\\pm}15.71\\upmu\\mathrm{m}$ 。与 $\\mathbf{GP}_{10-0}$ 相比，GP10-5 的孔径增大，这应该与PEGDA 的加入有关。当 GelMA/PEGDA 的比例增加时，冷冻凝胶层的孔径减小。以前的研究表明，孔径对于细胞迁移和增殖至关重要，组织工程的理想孔径范围为 $100{-}200\\upmu\\mathrm{m}^{[298-300]}$ 。因此，在后续研究中 GelMA:PEGEDA=10:5 wt%。  \n\n![](images/6f89507827b66717c0644daafdb81d1c275f6b2aa8fd0ef1ebf32cc23ff1c996.jpg)  \nFigure 3.8 (a) SEM images of: GP10-0, GP10-5 and GP15-5 at high and low  \n\nmagnifications. Scale bars $=50\\upmu\\mathrm{m}$ and $150~{\\upmu\\mathrm{m}}$ . (b) The pore diameters of $\\mathrm{GP_{10-0}}$ , GP10-5 and GP15-5, \\* and # represented $p<0.05$ when compared with $\\mathrm{GP_{10-0}}$ and $\\mathbf{GP}_{10}.$ - 5, respectively.  \n\nFigure 3.9a 是磺化 CFRPEEK 改性前后的 SEM 图像。在 SCP 表面观察到均匀的微孔结构和少量裸露的碳纤维。在基于自由基光聚合冷冻凝胶技术处理后，GP10-5 上形成了3D 海绵状大孔冷冻凝胶网络。当GO-HAP 的浓度低于 $100\\mathrm{ng/mL}$ 时，磺化 CFRPEEK 表面的冷冻凝胶层的形貌基本不受影响，并且 GO-HAP 纳米复合材料均匀分散在冷冻凝胶层中。当 GO-HAP 的浓度高于 $100~\\mathrm{{ng/mL}}$ 时，由于 GO 优异的光热转换效果，GelMA/PEGDA/GO-HAP 的上层冰晶在紫外辐照下会融化[301, 302]，使得冷冻凝胶层的大孔结构被上部塌陷的孔壁覆盖，这不利于营养物质和氧气的运输以及细胞迁移。此外，相关文献显示，低于 $1\\upmu\\mathrm{g/mL}$ 的低浓度GO 能够刺激细胞增殖，为成骨和血管生成创造有利的免疫环境[288]。因此，在本章中选择GO-HAP 的浓度低于 $100\\mathrm{ng/mL}$ 。Figure 3.9b 是 $\\mathbf{GP}_{10-5}$ 切片的横截面SEM 图像，磺化CFRPEEK 表面的GelMA/PEGDA 冷冻凝胶层厚度约为 $45\\upmu\\mathrm{m}$ ，并且可以观察到3D 海绵状大孔冷冻凝胶网络结构。  \n\n![](images/ba7024794d29e8db376bacc8b00a580060f6205f9b09ce02ab5cf831a968526a.jpg)  \nFigure 3.9 (a) SEM images of SCP, GP10-5, $\\mathrm{GH}_{25}$ , $\\mathrm{GH}_{50}$ , $\\mathrm{\\GH_{100}}$ , $\\mathrm{GH}_{150}$ and $\\mathrm{GH}_{200}$ , scale bars $=10\\upmu\\mathrm{m}$ and $200~{\\upmu\\mathrm{m}}$ . (b) SEM images of the $\\mathrm{GP_{10-5}}$ cross-section, scale bar  \n\n通过 XPS 测量不同样品的表面化学成分如 Figure 3.10 和 Table 3.4 所示。Figure 3.10a 为不同样品的 XPS 谱图。在 SCP 中，检测到 C 1s、O 1s 和 S 2p 峰。除了 C 1s 和 O 1s 峰外，在 $\\mathbf{GP}_{10-5}$ 中还检测到 N 1s 峰，这表明 GelMA/PEGDA冷冻凝胶已经成功接枝到磺化 CFRPEEK 表面。除了 C 1s、 O 1s 和 N 1s 峰外，$\\mathrm{GH}_{100}$ 还观察到约 $1.6~\\mathrm{wt\\%}$ Ca（Figure 3.10b）和 $0.96\\mathrm{wt\\%P}$ （Figure 3.10c），表明GO-HAP 纳米复合材料已成功掺入 GelMA/PEGDA 冷冻凝胶层中。SCP、 $\\mathbf{GP}_{10}.$ -$_5$ 和 $\\mathrm{GH}_{100}$ 的高分辨率C 1s 光谱进一步证明了每个改性步骤后表面化学状态的变化（Figure 3.10d）。SCP 的 C 1s 光谱在 $284.8~\\mathrm{eV}$ 、 $285.7\\ \\mathrm{eV}$ 和 $286.5\\ \\mathrm{eV}$ 处分别对应 C-C、C-O 和 $\\scriptstyle{\\mathrm{C=O}}$ 。在基于自由基光聚合冷冻凝胶技术处理后，在 GP10-5和 $\\mathrm{\\GH_{100}}$ 中观察到C-N（ $285.7\\mathrm{eV}$ ）和 COOH（ $288.7\\mathrm{eV}$ ）两个额外的峰，这进一步证明冷冻凝胶层已经成功地接枝在磺化 CFRPEEK 表面。  \n\n![](images/3f1f6ea90e2da74bf368bc002580da6e4d57e061dddd74a7e9e11af4c969b136.jpg)  \nFigure 3.10 (a) XPS spectra of SCP, $\\mathbf{GP}_{10-5}$ , $\\mathrm{GH}_{100}$ and high-resolution (b) $\\mathrm{Ca}2\\mathrm{p}$ and (c) $\\boldsymbol{\\mathrm{~P~}}2\\boldsymbol{\\mathrm{p}}$ spectra of GH100. (d) High-resolution C 1s spectra acquired from SCP, $\\mathbf{GP}_{10}.$ - 5 and GH100.  \n\nTable 3.4 Elemental composition of different substrate surfaces as determined by XPS.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>Material</td><td>C (%)</td><td>N (%)</td><td>0(%)</td><td>S (%)</td><td>Ca (%)</td><td>P(%)</td></tr><tr><td>SCP</td><td>58.84</td><td></td><td>40.06</td><td>1.09</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GP10-5</td><td>41.17</td><td>10.11</td><td>48.72</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GH100</td><td>44</td><td>12.46</td><td>40.97</td><td>---</td><td>1.6</td><td>0.96</td></tr></table></body></html>  \n\nFigure 3.11 是不同样品的水接触角测定结果，SCP 的水接触角为$110.75^{\\circ}\\pm3.46^{\\circ}$ ，显示出疏水特性。基于自由基光聚合冷冻凝胶技术处理后， $\\mathbf{GP}_{10}.$ 5 的水接触角为 $51.18^{\\circ}\\pm5.46^{\\circ}$ ，极大提高了磺化 CFRPEEK 的亲水性。在引入 GO-  \n\nHAP 后，GelMA/PEGDA/GO-HAP 修饰的磺化 CFRPEEK 仍然具有亲水性，并且水接触角随着GO-HAP 浓度的增加而增加（ $\\mathrm{GH}_{25}{\\cdot}43.60^{\\circ}{\\pm}3.39^{\\circ}$ ， $\\mathrm{GH}_{50}\\colon55.70^{\\circ}\\pm1.72^{\\circ}$ 和 GH100： $62.86^{\\circ}\\pm2.69^{\\circ}.$ ），亲水性的表面有利于细胞附着和增殖 [303]。  \n\n![](images/c99d1ea2c785c1a1805261f6c77c210fcd3112f5557dfc23f5f42c70fe5b6c72.jpg)  \nFigure 3.11 Water contact angles of SCP, GP10-5, GH25, GH50 and GH100. \\* and # represent $p{<}0.05$ when compared with SCP and $\\mathrm{GH}_{25}$ , respectively.  \n\n基于自由基光聚合的冷冻凝胶技术的原理如 Figure 3.12 所示。在零下温度（ $\\cdot-20^{\\circ}\\mathrm{C}$ ）下，在磺化 CFRPEEK 上的 GelMA/PEGDA/GO-HAP 凝胶前体液中的溶剂水会形成冰晶并与溶质发生相分离。在聚合之前或期间，冰晶会充当致孔剂，使得 GelMA/PEGDA/GO-HAP 能够在磺化 CFRPEEK 表面形成 3D 海绵状大孔结构。该大孔结构不仅提供了更多的营养和氧气，而且连通的孔结构还促进了细胞迁移和血管形成[304-306]( Figure 3.12a)。紫外辐照会使得 CFRPEEK 中的二苯酮结构产生自由基，并引发聚合物 GelMA 和 PEGDA 的烯基双键发生聚合反应，与CFRPEEK 形成 C-C 共价键，从而生成 GelMA 和 PEGDA 与 PEEK 的接枝共聚物，所以在 CFRPEEK 表面形成了一层 3D 海绵状大孔冷冻凝胶网络。GO-HAP纳米复合材料与GelMA/PEGDA 形成氢键以提高冷冻凝胶结构的稳定性( Figure3.12b)。  \n\n![](images/36800505b5f700f1cfed50bb63d0b82cf5b03e5e45ee3bef64836b2a4a999d57.jpg)  \n\n![](images/9f21dcc129a472d09215783bb4f2739601d41732fc3fd6ff58edd62a7ccb1ee5.jpg)  \nFigure 3.12 (a) Schematic depiction of the GelMA/PEGDA/GO-HAP cryogel on the surface of the sulfonated CFRPEEK formation. (b) Schematic illustration of the free radical polymerization on the surface of CFRPEEK.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 86,
        "chunk": "# 3.3.3 冷冻凝胶层的附着力  \n\n通过拉出法探究冷冻凝胶层在 CFRPEEK 表面上的附着力。如 Figure 3.13a所示，通过观察被测样品的断裂表面（红色圆圈），发现磺化 CFRPEEK 表面仍有残留的冷冻凝胶，并且基材未暴露，这表明冷冻凝胶层的拉伸强度低于冷冻凝胶层与磺化 CFRPEEK 表面的粘附强度[307]。如 Figure 3.13b 所示，当样品和锭子分离时，拉伸应力为 $3.94\\mathrm{MPa}$ 。先前的文献表明，仅通过等离子体处理的 PEEK表面的附着强度为 $1.1{-}3.0\\ \\mathrm{MPa}^{[308]}$ 。拉出试验有效证明了冷冻凝胶层在磺化CFRPEEK 表面具有良好的粘附稳定性。  \n\n![](images/5892dd233a3d93ea82ec48216e6c61efdea611c623f509aee0abd597344d9d9b.jpg)  \nFigure 3.13 (a) Image of $\\mathbf{GP}_{10-5}$ and the dolly after pull-off test. (b) Adhesion data of GP10-5.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 87,
        "chunk": "# $3.3.4\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放行为  \n\nGH25、GH50 和 $\\mathrm{{GH}_{100}}$ 在 PBS 中孵育 7 天后， $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放行为如 Figure 3.14所示。在第5 天时， $\\mathrm{GH}_{25}$ 中的 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 几乎被完全释放（ $.\\sim100\\%$ ），这不利于细胞的成骨分化；在 7 天内，GH50 和 $\\mathrm{{GH}_{100}}$ 的 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 连续释放，第 7 天的累计释放浓度分别为 $5.13{\\pm}0.10$ 和 $6.97{\\scriptstyle\\pm0.10}~{\\upmu\\mathrm{g/mL}}$ 。 $\\mathrm{GH}_{50}$ 和 $\\mathrm{GH}_{100}$ 中钙离子的长期稳定释放70  \n\n有利于CFRPEEK 植入物的长期成骨固定。  \n\n![](images/16e2b51f7784c3736d2e456b478a84a23aff20ee7e8b763faa02f3be161eaf75.jpg)  \nFigure 3.14 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ release profile of $\\mathrm{GH}_{25}$ , GH50 and GH100 over 7 days.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 88,
        "chunk": "# 3.3.5 体外矿化性能  \n\n植入物浸泡在 SBF 溶液中时产生骨状磷灰石的能力是探究体外骨结合能力的重要指标[260]。Figure 3.15 是在 SBF 中浸泡 7 天后不同样品表面形貌 SEM 图。在SCP 上几乎没有形成圆形结节，在 GP10-5 上沉积了一些结节，这是由于 GelMA的成核位点促进了骨状磷灰石的形成 [266, 267]。当引入GO-HAP 时，GHX（ $X=25$ ，50 和 100）表面几乎被球形颗粒完全覆盖，并且随着 GO-HAP 浓度的增加颗粒变大，这是因为GO-HAP 中的 HAP 为骨状磷灰石沉积物的形成提供了许多成核位点。上述结果表明，GO-HAP纳米复合材料促进了CFRPEEK的体外矿化性能，磺化 CFRPEEK 表面的 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶层具有良好的体外骨结合能力。  \n\n![](images/0578e24d79ac8b5eb3c7b146f0106179c96ce0f927d933dff58ec3547205ddd6.jpg)  \nFigure 3.15 SEM views of various specimens after 7 days of soaking in SBF.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 89,
        "chunk": "# 3.3.6 体外 BMSC 细胞相容性  \n\nBMSC 常用于探究生物材料的生物相容性和成骨能力，从 BMSC 的细胞增殖、粘附、扩散和迁移等方面研究各组的细胞相容性。通过 CCK-8 检测 BMSC细胞增殖情况如 Figure 3.16 所示。在 BMSC 与各组样品共培养 4 天后， SCP 的生物惰性使得它在促进细胞增殖方面表现最差， $\\mathrm{\\GH_{100}}$ 表现最好；当培养延长至7 天后，各组BMSC 的细胞活力均显著提高，且 $\\mathrm{\\GH_{100}}$ 的细胞活力相较于 SCP 提高了 $24.41\\%$ 。根据上述细胞增殖结果，BMSC 细胞在 GelMA/PEGDA/GO-HAP冷冻凝胶修饰CFRPEEK 表现出更好的细胞活力。  \n\n![](images/2bed2e4c44b1580fdbde62c02146fd27dfcf1c13e16ea067d45b5058c0bae520.jpg)  \nFigure 3.16 Cell proliferation after 1, 4 and 7 days of culture on various substrates, \\*, # and & represented $p<0.05$ when compared with SCP, GP10-5 and $\\mathrm{GH}_{25}$ , respectively.  \n\nBMSC 细胞在不同样品上的形态如Figure 3.17 所示。SCP 上的细胞呈球状，细胞边缘有少量附着的丝状伪足，这是由于 SCP 的生物学惰性表面阻碍了细胞的粘附和扩散。除SCP 外，其他各组上的细胞以纺锤形扩散，在培养 24 小时后，几乎覆盖了整个样品表面。  \n\n![](images/f8f00b4d7853c1fa0f54395a55d37a27e9f97eb30a3ee0364a2a478ed02151c8.jpg)  \nFigure 3.17 SEM images of BMSCs adhered to various substrates after one day of incubation.  \n\n为了进一步研究 BMSC 细胞在不同 CFRPEEK 样品上的粘附行为，通过CLSM 图像观察 BMSC 细胞在所有样品上培养 24 小时后的细胞骨架和细胞核。如Figure 3.18 所示，BMSC 细胞在除 SCP 外的样品上扩散良好，细胞间有更多的互联和重叠，产生更成熟的肌动蛋白，这表明冷冻凝胶层有利于细胞的粘附和扩散。BMSC 细胞的 SEM 和 CLSM 图像及细胞增殖结果表明，磺化 CFRPEEK植入物表面的 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶层具有更优异的细胞相容性。上述实验结果归因于冷冻凝胶层的亲水三维海绵状大孔网络结构为细胞提供了丰富的附着位点，并且 GelMA 的 RGD 序列和 GO-HAP 中的 GO 能够协同促进细胞粘附和增殖[291, 309]。  \n\n![](images/12c0f5bb75f0b6bebfbd035f82d3a264e1d99b88ae57f11385b956b62b5554c9.jpg)  \nFigure 3.18 CLSM of BMSCs incubated for 24 hours on various substrates. TRITCphalloidin staining in red represented cytoskeleton, whereas DAPI staining in blue represented cell nuclei, scale bar ${\\tt\\operatorname=}50\\upmu\\mathrm{m}$ .  \n\n通过体外 Transwell 细胞迁移实验探究不同样品对 BMSC 细胞的迁移影响。如 Figure 3.19a 所示，培养 24 小时后，在 SCP 和 $\\mathbf{GP}_{10-5}$ 中仅观察到少量迁移的BMSC 细胞。 $\\mathrm{GH_{X}}$ （ $X=25$ ，50 和 100）显著增强了 BMSC 细胞的迁移，并且从Figure 3.19b 中可以观察到 $\\mathrm{GH}_{100}$ 的 BMSC 细胞迁移数量相对于 SCP 增加了$101.06\\%$ ，这是由于 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶释放的 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 可以促进BMSC 的迁移。  \n\n![](images/9cc4bdb5f75682c3d5b5930e6ababa8f547857931703664a7e604346c2388648.jpg)  \nFigure 3.19 (a) Migration assay of BMSCs exposed to different substrates for $24\\mathrm{h}$ ,  \n\nscale bar ${\\tt\\mathrm{=}}200\\ {\\upmu\\mathrm{{m}}}$ . (b) Number of migrated BMSCs on different substrates,\\* and # represented $p<0.05$ when compared with SCP and GP10-5, respectively.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 90,
        "chunk": "# 3.3.7 体外成骨性能  \n\nFigure 3.20a 是不同 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 样品和 BMSC 细胞共培养 7 天和 14 天的 ALP 活性定量分析图。SCP 表现出最差的ALP 活性，与其他组之间有显著性差异。GHX（ $X=25$ ，50 和 100）的 ALP 活性高于 GP10-5，并且 GH100 在第 14 天的 ALP 活性相较于 SCP 提高了 $157.08\\%$ ，这与 ALP 染色结果一致（Figure 3.20b）。在培养 14 天后， $\\mathrm{\\GH_{100}}$ 表面ALP 染色是最深的。以上的结果说明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 可以促进BMSC 细胞的早期分化。  \n\n![](images/dcfe65883a2f59f51aae87452c4ba9d4486dd51320e1e8c10c657bde2089a54a.jpg)  \nFigure 3.20 (a) Alkaline phosphatase (ALP) activity after osteogenic induction on various samples for 7 and 14 days, \\* represented $p<0.05$ when compared with SCP.  \n\n(b) ALP staining on various samples.  \n\n细胞外基质矿化是成骨细胞晚期分化的标志[276]。在与BMSC 细胞共培养 21天后，利用ARS 染色法探究不同样品表面的细胞外基质矿化情况。Figure 3.21a为不同样品表面的ARS 染色结果。与ALP 染色结果相似，在第 21 天时，在 $\\mathbf{GP}_{10}.$ -5 表面观察到比SCP 更多、更大的红色钙化结节。在 $\\mathrm{GH_{X}}$ （ $X=25$ ，50 和 100）表面上观察到更多的深红色结节区域，特别是 $\\mathrm{GH}_{100}$ ，这表明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 成骨能力显著增强。Figure 3.21b 为不同样品表面细胞外基质矿化的定量分析结果， $\\mathrm{GH}_{100}$ 表面的钙化结节量相对于 SCP 增多了$65.18\\%$ 。根据上述研究结果，多功能的三维海绵状大孔冷冻凝胶层参与了成骨分化过程，并进一步促进了磺化 CFRPEEK 的晚期成骨分化。  \n\n![](images/7d6287b15bf0d737576f3fc7c0050ef98ff1bc9b558e8eb44b5ca80afbd187c6.jpg)  \nFigure 3.21 (a) Calcium deposition on various sulfonated CFRPEEK substrates after culture of BMSCs for 21 days, \\* and # represented $p<0.05$ when compared with SCP and GH25, respectively. (b) Alizarin red staining (ARS) on various samples.  \n\n为了进一步验证GelMA/PEGDA/GO-HAP冷冻凝胶修饰CFRPEEK对BMSC细胞成骨分化的影响，通过 RT-PCR 探究了不同样品上 BMSC 细胞成骨相关基因（ALP、Col-Ⅰ、BMP-2 和 Runx2）的表达水平。结果如 Figure 3.22 所示，与SCP 相比， $\\mathbf{GP}_{10-5}$ 和 $\\mathrm{GH_{X}}$ （ $X=25$ ，50 和100）的成骨相关基因的表达均增加。在培养14 天时， $\\mathrm{GH}_{100}$ 中的 ALP、Col-Ⅰ、BMP-2 和 Runx2 的表达水平相关比 SCP中 的 分 别 提 高 了 $151.11\\%$ 、 $89.79\\%$ 、 $150.19\\%$ 和 $116.36\\%$ ， 这 表 明GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 具有显著的促进成骨的能力。GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶层的 3D 海绵状大孔、GO 和 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 在促进CFRPEEK 成骨性能方面具有协同作用。3D 海绵状大孔冷冻凝胶层具有适当的孔径和良好的孔隙渗透性，能够促进 BMSC 细胞的粘附、迁移和矿化[292, 310]。以往研究表明，GO 能在一定程度上促进成骨细胞和干细胞的成骨分化[311]。GO 还作为 HAP 的载体和释放平台，可以不断释放 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ ，促进细胞骨架与细胞外基质间的识别和粘附，从而增强成骨细胞的增殖和分化能力[292, 298]。因此，3D 海绵状大孔冷冻凝胶和 GO-HAP 纳米复合材料在增强磺化 CFRPEEK 的成骨能力、促进BMSC 细胞中ALP 的分泌和细胞外基质矿化、刺激成骨相关基因的表达方面发挥了重要作用。  \n\n![](images/23b78c0afd267846fe47f77ae9e3d080d4465c161e9b0307408adc9020a82191.jpg)  \nFigure 3.22 Quantification the expression of ALP, Col-Ⅰ, BMP-2 and Runx2 after BMSCs culturing on various samples for 7 and 14 days by RT-PCR, \\*, # and & represented $p<0.05$ when compared with SCP, GP10-5 and GH25, respectively.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 91,
        "chunk": "# 3.3.8 体外成血管性能  \n\n内皮细胞的血管生成和干细胞的成骨在骨重塑过程中是相辅相成的[312]。通过对 HUVEC 在 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 上的细胞增殖、粘附、扩散、迁移和管的形成能力等的研究来判断 GelMA/PEGDA/GO-HAP冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 的血管生成潜力。HUVEC 在不同样品上培养 1 和 3 天后的增殖结果如Figure 3.23 所示。1 天后，每组样品间细胞增殖无显著差异； 3天后，所有样品的细胞增殖均明显提高； $\\mathrm{GH_{X}}$ （ $X=25$ ，50 和 100）的细胞增殖明显高于其他两组，其中GH100的HUVEC细胞增殖水平相较于SCP提高了 $14.53\\%$ ，这表明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 具有优越的 HUVEC细胞相容性。  \n\n![](images/f5e9c52a1738ecdba66a41af254f5737b5be620798dce6bdc1ce88e205bcf3d2.jpg)  \nFigure 3.23 HUVEC proliferation on various samples after culturing for 1 and 3 days,\\*, #, $\\&$ and $\\mathfrak{a}$ represented $p<0.05$ when compared with SCP, GP10-5, GH25 and GH50.  \n\n利用 CLSM 图像观察 HUVEC 细胞在不同样品上的细胞骨架（红色）和细胞核（蓝色），如Figure 3.24a 所示。与SCP 相比，其他样品上的 HUVEC 细胞，特别是GH100，扩散良好、产生更成熟的肌动蛋白，并且生成更多的微血管结构。使用 Image J 软件分析 HUVEC 在不同 CFRPEEK 表面的相对位置，以判断HUVEC 在不同样品表面上的迁移能力。结果如 Figure 3.24b 所示，在 GP10-5 和GHX（ $X=25$ ，50 和 100）上的 HUVEC 细胞比 SCP 扩散得更深，这是由于冷冻凝胶层相互连接的大孔结构能够吸收大量的水，提供足够的氧气和营养物质，促进HUVEC 细胞生长、扩散并向下迁移，从而形成三维微血管结构[296]。  \n\n![](images/cdf663b76a2a7ac6febdd058fecca0f814b32f0c48974c86c3857413a54d736f.jpg)  \nFigure 3.24 (a) CLSM of HUVECs incubated on different substrates for 3 day.  \n\nTRITC-phalloidin staining in red represented cytoskeleton, whereas DAPI staining in blue represented cell nuclei, scale bar ${\\tt\\mathrm{=}}40{\\upmu\\mathrm{m}}$ . (b) Representative 3D CLSM images of HUVEC migration into different substrates stained using TRITC-phalloidin for cytoskeletal organization. scale bars $=40~{\\upmu\\mathrm{m}}$ .  \n\n利用体外Transwell 细胞迁移实验研究不同样品对HUVEC 细胞的迁移影响，结果如 Figure 3.25a 所示。培养 24 小时后，在 SCP 仅观察到少量的 HUVEC 细胞迁移，在 GHX（ $X=25$ ，50 和 100）中观察到明显的细胞迁移。定量分析结果表明 HUVEC 细胞在 GH100 上的迁移数量相对于 SCP 增多了 $166.62\\%$ （Figure3.25b），这说明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 能够促进HUVEC 细胞迁移。  \n\n![](images/b3387c5621a2e59e9bc71f54f4cc967d513f84c2ea1e99598395fca2fef7159c.jpg)  \nFigure 3.25 (a) Migration assay of HUVECs exposed to different substrates for $24\\mathrm{h}$ , Scale bar ${\\tt\\tau}=200{\\upmu\\mathrm{m}}$ . (b) Number of migrated HUVECs on different substrates,\\* and # represented $p<0.05$ when compared with SCP and GP10-5, respectively.  \n\n通过在基质胶上培养 HUVEC 研究 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰CFRPEEK 的管形成能力，分析结果如 Figure 3.26a 所示。暴露于 SCP 的 HUVEC仅有少量的管形成。与 SCP 相比， GH100 上的 HUVEC 的管形成明显增加。使用 Image J 计算形成管的总分支长度，结果如 Figure 3.26b 所示。在 GH100 上形成的管的分支长度最长，相较于 SCP 增长了 $111.18\\%$ ，血管网络结构最密集，这说明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 能够在体外诱导血管生成。根据之前的报道，许多研究人员已经将 GO 用于组织工程植入物，并发现适当浓度的GO 可以有效地诱导血管生成。石墨烯基材料还能够从已有的血管系统中形成新的毛细血管[313, 314]。  \n\n![](images/7d65787470a9672e96c755e6bcb288f503da2f17686e5589b2cf46943edb345d.jpg)  \n\nFigure 3.26 (a) Tube forming ability of HUVECs cultured on Matrigel, Scale bar   \n${\\tt\\tau}=200\\ \\upmu\\mathrm{m}$ . (b) Total branching length the formed tube on different samples, ,\\*, #, & and a represent $p<0.05$ when compared with SCP, GP10-5, GH25 and GH50, respectively.  \n\n综上所述，3D 海绵状大孔 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK增强了HUVEC 的增殖、粘附和迁移并加速了管的形成，这些结果与之前的研究一致，即3D 海绵状大孔结构有利于细胞的粘附和扩散，GO-HAP 中的GO 进一步促进了细胞的迁移和血管生成。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 92,
        "chunk": "# 3.3.9 体内成骨整合性能探究  \n\n细胞实验结果表明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 表现出优异的体外血管化和成骨特性，说明这类材料具备了作为骨科植入物的基本条件。它的骨整合性能的优劣还需要通过体内组织对 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰CFRPEEK 的反应来研究。为此，本研究团队建立了大鼠颅骨缺损模型，以探究多功能磺化CFRPEEK 植入物的体内骨重塑能力。基于在体外细胞实验中表现出优越性能，选择 $\\mathrm{GH}_{100}$ 进行大鼠颅骨缺损植入实验。将不同的CFRPEEK 植入物（SCP、GP10-5、GH100）植入大鼠颅骨两侧，其中以空白孔（Blank）作为对照组。在术后4 周和12 周，用micro-CT 扫描含有植入物的颅骨，以探究新骨的生成情况。各组 CFRPEEK 植入物周围新生骨组织的 2D 和 3D 重建图像如Figure 3.27a 所示。在术后 4 周，每组植入物周围都有少量新骨生成。植入 12周后，SCP 植入物周围新生骨的数量大于空白组， $\\mathbf{GP}_{10-5}$ 和 $\\mathrm{\\GH_{100}}$ 周围的新生骨数量均明显大于其他两组，其中 GH100 植入物几乎完全被新生骨组织包围，这表明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶的修饰促进了磺化 CFRPEEK 植入物的骨修复能力。Figure 3.27b 是新生骨组织参数的定量分析结果，包括骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数（Tb.N）和骨小梁厚度(Tb. Th)。在第 12 周， $\\mathrm{\\GH_{100}}$ 的新生骨的 BV/TV、 Tb.N 和 Tb. Th 相较于 SCP 增加了 $72.96\\%$ 、 $78.95\\%$ 和 $34.98\\%$ ，这说明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶层显著的提升了 CFRPEEK 的骨重塑和骨整合能力。  \n\n![](images/772ce123815b4b28730db83c2b6e2dc1bd32cb07d405f92bd5251765bbc15f11.jpg)  \nFigure 3.27 (a) 2D and 3D reconstruction images by micro-CT scanning after 4 and  \n\n12 weeks implantation (red dotted frame denotes the bone defect site). (b)   \nQuantitative analysis of Micro-CT data including BV/TV, Tb.N, and Tb.Th at 4 and   \n12 weeks, \\*, # and $\\&$ represent $p<0.05$ when compared with the blank, SCP and GP10-5, respectively.  \n\n为了进一步探究不同 CFRPEEK 植入物周围新生骨组织和新血管的生成情况，在植入 4 周和 12 周后对颅骨标本进行组织学染色（H & E、Masson 和 VanGieson 染色）。如 Figure 3.28 所示，黑点（长碳纤维）和棕色（PEEK 基质）的混合区域代表CFRPEEK 植入物。在实验动物的颅骨中未发现炎症或坏死，这说明植入物无毒且具有长期的生物相容性。H  &  E、Masson 和 Van Gieson 染色结果显示，在手术4 周后，SCP 植入物周围形成了一层薄薄的骨样基质（红色箭头）。GP10-5 和 $\\mathrm{\\GH_{100}}$ 比SCP 形成了更广泛的类骨基质区域。当时间延长到 12 周时，不同植入物周围的新生骨增加，更多成熟的新骨（黑色箭头）牢固地附着在GH100 上，并在其表面扩张，这表明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰CFRPEEK 植入物具有良好的新骨生成能力。GH100 上还生成了更多的新血管（绿色箭头）[278, 315]，这与体外血管生成结果一致。上述结果表明，3D 海绵状大孔GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶层能显著加速体内的骨沉积和新血管的生成，提高了CFRPEEK 植入物的骨整合能力，为多功能骨科植入物的开发提供了更多的可能。  \n\n![](images/665c283a8d34fda3f7fb6ab1462f6e600457de49b2ac24e62863730fb02843a2.jpg)  \nFigure 3.28 H & E, Masson and Van Gieson staining of the calvarial defect regions after treatment with different samples for 4 and 12 weeks. [M, Materials; NB, new bone (black arrows); NV, new vessels (green arrows); OM, osteoid matrix (red arrows)].  \n\n除体内骨整合能力外，体内生物毒性是 CFRPEEK 能否作为骨科植入物的重要标准。植入12 周后，用H & E 染色法探究实验动物的主要器官是否发生病变。  \n\nFigure 3.29 为实验大鼠的心、肝、脾、肺和肾的组织染色图像。从染色结果可以看出，实验大鼠的主要器官的结构保持正常，没有明显的器官损伤或炎性损伤，这说明多功能磺化CFRPEEK 植入物作为成骨植入物没有明显的生物毒性。  \n\n![](images/5e2fcd4b06a09c32bd1bb983e0f397db6f8503fcf88104bff81cba8aa2ea3797.jpg)  \nFigure 3.29 Histological observation of H & E staining of tissues (heart, liver, spleen, lung, and kidney) after 12 weeks of treatments, scale bar $=40\\upmu\\mathrm{m}$ .",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 93,
        "chunk": "# 3.4 本章小结  \n\n通过原位键合法制备了 GO-HAP 纳米复合材料，再基于自由基光聚合的冷冻凝胶技术开发了一种多功能GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰CFRPEEK植入物。  \n\n（1）体外成血管实验表明，在 GH100 上形成的管的分支长度最长，相较于SCP 增长了 $111.18\\%$ ，血管网络结构最密集，这说明该多功能植入物表面的 3D海绵状大孔结构和GO 促进了 HUVEC 细胞的长入和迁移，增强了 CFRPEEK 植入物的体外成血管能力。  \n\n（2）优异的表面亲水性和钙离子的受控释放有利于 BMSC 细胞的增殖、粘附和成骨分化，其中 BMSC 细胞在 $\\mathrm{\\GH_{100}}$ 上的增殖相较于 SCP 提高了 $24.41\\%$ ，ALP 活性提高了 $157.08\\%$ 。  \n\n（3）大鼠颅骨缺损实验进一步表明， $\\mathrm{GH}_{100}$ 周围的新生骨的骨小梁数目相较于SCP 提高了 $78.95\\%$ ，这说明 GelMA/PEGDA/GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK植入物可以迅速诱导新骨生成和新血管生成，显著提高了 CFRPEEK 植入物的成骨固定和骨重塑能力。  \n\n综上所述，本研究为开发具有血管生成能力的骨科植入物提供了新的思路，并扩大了CFRPEEK 材料的临床应用范围。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 94,
        "chunk": "# 第 4 章 pH 响应性 MOF 水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备及其免疫/成血管/成骨能力的研究",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 95,
        "chunk": "# 4.1 前言  \n\n骨缺损处的骨整合是一个复杂的动态过程，包括三个阶段：炎症反应、血管生成和新骨生成[316, 317]，这三个阶段不是孤立的，而是相互重叠和协同的。巨噬细胞的免疫反应、内皮细胞的血管生成和成骨细胞的骨新生，每个阶段都可以通过一些共同的细胞间信号通路与其它阶段相互作用[318-320]。植入物和组织之间的相互作用总是发生在植入物表面上，控制和改善植入物的表面特性来优化植入物的生物相容性和生物活性是一种有效的促进骨整合方法[321]。在植入物植入后，如果上述细胞能够首先到达并占据植入物表面，则可以促进界面处的骨结合，延长植入物在体内的寿命。在前两章工作的基础上，本章工作拟进一步通过表面多功能设计提高 CFRPEEK 植入物的抗炎、血管生成和成骨能力，从而增强CFRPEEK 的骨整合性能以保持植入物与组织界面的长期稳定性。  \n\n羟基磷灰石以纳米针状晶体存在人体骨骼中 [322, 323]，这些纳米晶体的有序排列使得骨组织具有机械性能[324]。在骨科植入物中掺入纳米羟基磷灰石有望改善骨科植入物的超微结构和骨传导性[325]。  \n\n金属有机框架（MOF）是具有多孔结构的有机-无机杂化材料，通过在金属离子/团簇和有机配体之间形成配位键而制成 [326-329]。因其多变的结构、大的比表面积、优异的载药能力和生物降解性受到研究人员的广泛关注[330]。  \n\n$\\mathrm{Mg^{2+}}.$ 是人体骨骼中的一种微量元素，在骨代谢过程中维持着局部微环境的平衡。近年来，研究人员试图通过在骨植入物中添加生物活性 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 来诱导血管化骨愈合[331, 332]。 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 可以调节细胞行为，包括增强细胞粘附和促进细胞分化，还可以促进新血管生成并刺激骨局部再生和愈合，从而增强骨整合[333, 334]。 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 能影响巨噬细胞的极化，控制炎性细胞因子的释放，抑制骨微环境中的炎症反应[335]。  \n\n没食子酸（GA）是一种低分子量的植物衍生有机茶多酚[336]。它在抗炎和抗氧化方面具有良好的治疗作用，在免疫细胞分化、激活和维持免疫系统稳定性的过程中发挥一系列作用[337, 338]。多项研究证明，GA 通过影响巨噬细胞相关蛋白的表达以及M1 型巨噬细胞极化来调整炎症反应[339, 340]。  \n\n由 GA 和 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 制备的Mg-GA 金属有机框架（MOF）具有生物相容性、血管生成和抗炎特性[334,341]。虽然先前的研究表明，将 HAP 或Mg-GA 单独结合到骨植入物中可以增强植入物在体内的骨整合，但同时使用它们来促进骨植入物的骨整合和骨生成的实例很少。  \n\n本研究考虑到植入物在植入后的不同骨整合阶段所需的炎症反应、血管生成和成骨特性，设计并开发了核壳结构的羟基磷灰石 $@$ 镁-没食子酸（HAP@Mg-GA）MOF 纳米颗粒，其中纳米羟基磷灰石为核层，Mg-GA 为壳层。通过紫外辐照的方法在磺化 CRPEEK 表面上制备羟基磷灰石 $@$ 镁-没食子酸/甲基丙烯酰化壳聚糖（HAP@Mg-GA/CSMA）MOF 水凝胶层。CSMA 是可以通过光引发聚合且对pH 高度敏感，所以它不仅可以将核壳结构的 MOF 纳米颗粒负载到磺化CFRPEEK 的表面，还可以在低 pH 条件下控制 $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA~MOF}$ 纳米颗粒中生物活性物质的持续释放。在骨整合早期阶段（低 $\\mathrm{\\pH}\\mathrm{\\cdot}$ ），负载在 CSMA 水凝胶上的HAP@Mg-GA 首先准确地释放抗炎药物GA 和微量元素 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 来应对炎症反应，为接下来的成骨分化创造良好的免疫微环境。同时，释放的 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 还可以促进血管的原位生成。在骨整合的晚期（pH 值为 7.4），钙的长期持续释放有利于新骨的生成，恢复植入物周围的骨稳态，以及促进骨-植入物的整合。在磺化CFRPEEK 植入物的表面上构建 pH 响应的 MOF 水凝胶，有利于 CFRPEEK 植入物适应植入后的动态骨整合过程。本章通过对改性CFRPEEK 植入物的表面形貌、亲水性、表面电势、蛋白吸附能力、不同 pH 下的缓释行为和体外矿化能力进行研究，探究了 pH 响应性 MOF 水凝胶修饰 CFRPEEK 植入物的性能优势；通过体外细胞实验，研究了改性CFRPEEK 植入物的抗炎、成血管和成骨能力；通过大鼠皮下植入和兔胫骨缺损实验，研究了该植入物在体内抗炎、成血管和成骨分化行为。总的来说，研究结果为设计改进骨科植入物提供了一种新颖的策略，并为惰性生物材料表面的多功能设计提供了一个实用的选择。Figure 4.1 为本章的技术路线示意图。  \n\n![](images/64558ed95cc44ea92260c21f5c2cc3a240a7730f8429f05dbfcf320db941e325.jpg)  \nFigure 4.1 (a) Diagram depicting the synthesis of HAP@Mg-GA MOF nanoparticles.  \n\n(b) Preparation of stimuli-responsive metal–organic framework hydrogel-decorated sulfonated CFRPEEK implants. (c) Schematic illustration of stimuli-responsive metal–organic framework hydrogel-decorated sulfonated CFRPEEK implants for enhanced osseointegration (regulation of inflammation response, angiogenesis, and bone regeneration).",
        "category": " Introduction"
    },
    {
        "id": 96,
        "chunk": "# 4.2 实验部分",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 97,
        "chunk": "# 4.2.1 实验材料与仪器",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 98,
        "chunk": "# 1. 实验材料  \n\nTable 4.1 The materials and reagents.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>名称</td><td></td><td>缩写　产品规格</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>纳米羟基磷灰石</td><td>HAP</td><td>≥97%</td><td>上海阿拉丁生化科技股份有限公司</td></tr></table></body></html>  \n\n<html><body><table><tr><td>名称</td><td>缩写</td><td>产品规格</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>MgCl2</td><td>AR</td><td>上海阿拉丁生化科技股份有限公司</td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>CS</td><td>200-</td><td>上海阿拉丁生化科技股份有限公司</td></tr><tr><td></td><td></td><td>400</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>mPa.s</td><td></td></tr><tr><td>没食子酸</td><td>GA</td><td>AR</td><td>上海易恩化学技术有限公司</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>KOH</td><td>AR</td><td>北京化工厂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>BSA</td><td>>98%</td><td>上海碧云天公司</td></tr><tr><td>IL-10/ TNF-α 酶联免</td><td></td><td></td><td>美国英杰生命技术有限公司</td></tr><tr><td>疫试剂盒</td><td></td><td></td><td>（ Invitrogen）</td></tr><tr><td>脂多糖</td><td>LPS</td><td>AR</td><td>上海碧云天公司</td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠 CD206</td><td></td><td></td><td>BioLegend</td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE 抗iNOS 抗体</td><td></td><td></td><td>BioLegend</td></tr><tr><td>活性氧检测试剂盒</td><td>ROS</td><td></td><td>上海碧云天公司</td></tr><tr><td></td><td>Assay</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-氧化氮检测试剂盒</td><td></td><td></td><td>上海碧云天公司</td></tr><tr><td>24孔 Transwell 小室</td><td></td><td>3422</td><td>美国康宁公司</td></tr><tr><td>基质胶</td><td></td><td>无酚红</td><td>BD 生物科学技术有限公司</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td></td><td>AR</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td></tr><tr><td>CD86一抗</td><td></td><td></td><td>武汉赛维尔生物科技有限公司</td></tr><tr><td>CD163一抗</td><td></td><td></td><td>武汉赛维尔生物科技有限公司</td></tr><tr><td>CD31一抗</td><td></td><td></td><td>武汉赛维尔生物科技有限公司</td></tr><tr><td>Zoletil 50</td><td></td><td></td><td>法国virbac 公司</td></tr><tr><td>速眠新</td><td></td><td></td><td>吉林省敦化市圣达动物药品有限公</td></tr><tr><td colspan=\"2\"></td><td>司</td><td></td></tr></table></body></html>\n\n涉及的其它实验材料与第二章相同，详见 2.2.1 表 Table 2.1。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 99,
        "chunk": "# 2. 实验仪器  \n\nTable 4.2 The experimental apparatus.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>仪器名称</td><td>型号</td><td>生产厂家</td></tr><tr><td>Revetest划痕测试仪</td><td>Revetest</td><td>安东帕（上海）商贸有限 公司</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>HT7800 (TEM)</td><td>日立株式会社</td></tr><tr><td>接触角测量仪</td><td>DSA25</td><td>德国KRUSS公司</td></tr><tr><td>固体表面 Zeta电位分析</td><td>SurPASS (EDS)</td><td>安东帕（上海）商贸有限</td></tr><tr><td>仪</td><td></td><td>公司</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>FACS Calibur</td><td>美国BD生物科学公司</td></tr><tr><td>电感耦合等离子体发射光</td><td>（ ICP-</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent  725</td><td>安捷伦科技（中国）有限</td></tr><tr><td>谱仪</td><td>OES)</td><td>公司</td></tr></table></body></html>\n\n涉及的其它实验仪器与第二章相同，详见 2.2.1 表 Table 2.2。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 100,
        "chunk": "# 4.2.2 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的制备与表征  \n\nHAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒是通过纳米羟基磷灰石、 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 和GA 之间的库仑相互作用和螯合作用制得的，即纳米羟基磷灰石的 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 与没食子酸的-COO-之间的库仑相互作用和螯合作用首先诱导没食子酸在纳米羟基磷灰石上沉积。当纳米羟基磷灰石表面的 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 完全被没食子酸覆盖，没食子酸暴露出的-COO-与 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 之间的库仑相互作用和螯合作用使得 Mg-GA 壳沉积到纳米羟基磷灰石上，最后形成了核壳结构的 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒[342, 343]。Figure 4.1a 是 ${\\mathrm{HAP}}@{\\mathrm{Mg-}}$ GA 制备技术路线图。具体实验步骤如下：  \n\n将1g 的纳米羟基磷灰石超声分散到 $100\\mathrm{mL}$ 的去离子水中，随后用 $10\\mathrm{M}$ 的KOH 水溶液调节 pH 在 8-9 之间；将 $0.19\\mathrm{g}$ 没食子酸和 $0.05\\mathrm{g}$ 氯化镁分别加入到纳米羟基磷灰石分散液中，将此混合液放入三颈烧瓶中，于 $120^{\\circ}\\mathrm{C}$ 回流搅拌，反应 $24\\mathrm{h}$ ，冷却至室温，然后进行高速离心处理，取 $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA}$ 沉淀物；沉淀物用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤三次，并以 $10000\\mathrm{rpm}$ 高速离心回收；将回收的沉淀物在 $60^{\\circ}\\mathrm{C}$ 的真空烘箱中干燥 $24\\mathrm{~h~}$ ，得到棕褐色的核壳结构的羟基磷灰石 $@$ 镁-没食子酸MOF 纳米颗粒（ $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA})$ ）。  \n\n使用 XRD 和 XPS 检测了 HAP $@$ Mg-GA 的晶体结构和组成；通过 TEM 和  \n\nSEM 分析了 GO-HAP 的形貌。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 101,
        "chunk": "# 4.2.3 甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）的制备与表征  \n\n甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）是按照文献报道的方法制备的[344]。具体如下：  \n\n配制 $200\\mathrm{mL}1.5\\%$ 壳聚糖溶液，溶剂为 $4\\%$ （v/v）醋酸溶液， $40^{\\circ}\\mathrm{C}$ 磁力搅拌直至壳聚糖溶解；向上述溶液中缓慢滴加 $16~\\mathrm{mL}$ 的甲基丙烯酸酐， $40^{\\circ}\\mathrm{C}$ 避光磁力搅拌反应 3 小时；反应完成后，将反应液置于透析袋中，用蒸馏水透析 7 天，除去未反应的甲基丙烯酸酐；将透析液在真空冷冻干燥机中干燥，得到甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）。  \n\n在常温条件下，将少量的壳聚糖和甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）分别溶解于含 $2\\%$ 氘代乙酸的氘代水（ $\\mathrm{\\DeltaD}_{2}\\mathrm{O}$ ）中，通过 $400\\mathrm{MHz}$ 核磁共振波谱仪测定它们的 $^1\\mathrm{H}$ NMR 谱，以判断甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）的分子结构。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 102,
        "chunk": "# 4.2.4 磺化 CFRPEEK 复合材料的制备  \n\n磺化 CFRPEEK 复合材料的制备步骤与第三章相同，详见 3.2.3 磺化CFRPEEK 复合材料的制备，其中尺寸为 $\\Phi\\ 8{\\times}1.5\\ \\mathrm{mm}$ 的磺化 CFRPEEK 用于表面表征、体外细胞实验和大鼠的皮下植入实验，尺寸为 $\\Phi\\ 5\\times6\\ \\mathrm{mm}$ 的磺化CFRPEEK 用于兔的胫骨缺损实验。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 103,
        "chunk": "# 4.2.5 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的制备  \n\n（1）CSMA/ HAP@Mg-GA 凝胶前体液的制备  \n\n在避光条件下，将 HAP@Mg-GA 按照 $0.5\\ \\mathrm{wt\\%}$ 的浓度加入到配制好的 3wt%CSMA 水溶液中。为了使 HAP@Mg-GA 均匀的混合到 CSMA 水溶液中，将混合溶液先超声分散 $30\\ \\mathrm{min}$ 再在室温下磁力搅拌 $8\\mathrm{~h~}$ ，这样就得到了CSMA/HAP@Mg-GA 凝胶前体液。  \n\n（2）MOF 水凝胶修饰 CFRPEEK 的制备  \n\n在避光条件下，将磺化 CFRPEEK 复合材料按 $100~{\\upmu\\mathrm{L}}/{\\mathrm{cm}}^{2}$ 的比例浸入含有HAP@Mg-GA/CSMA 水凝胶前体液 $(\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA:0.5wt^{0}/_{0},C S M A:3w t^{0}/_{0}})$ 中，在室温下静置 $15{-}30\\ \\mathrm{min}$ ，使得具有多孔结构的磺化 CFRPEEK 复合材料与  \n\nHAP@Mg-GA/CSMA 混合溶液充分接触。在保护气氛下，将浸没在溶液中的CFRPEEK 置于在波长 $365~\\mathrm{nm}$ 、光强 $10\\mathrm{\\mW/cm^{2}}$ 的紫外灯下辐照 $60~\\mathrm{{min}}$ 。完成后，将上述CFRPEEK 浸泡在蒸馏水中，以除去未反应的水凝胶前体液，最后在冷冻干燥机里进行干燥备用。  \n\n各组CFRPEEK 样品用如下缩写表示：  \n\nSCP：磺化 CFRPEEK；  \n\nMACS: 甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）修饰的磺化 CFRPEEK（CSMA:3wt%）;HAP: 纳米羟基磷灰石/甲基丙烯酰化壳聚糖（Nano-HAP/CSMA）修饰的磺化CFRPEEK（HAP:0.5wt%,CSMA:3wt%）;  \n\nMGH: 羟基磷灰石 $@$ 镁-没食子酸/甲基丙烯酰化壳聚糖（HAP@Mg-GA/CSMA）修饰的磺化 CFRPEEK（HAP@Mg-GA:0.5wt%,CSMA:3wt%）。  \n\n采用SEM 对各组样品的表面形貌和截面形貌进行表征； ATR-FTIR 和EDS 用于表征各组样品的表面化学组成；每个样品组的水接触角使用接触角测量仪测定，每个样品在3 个不同的区域进行测定，每组样品重复测定 2 次。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 104,
        "chunk": "# 4.2.6 水凝胶层的附着力测试  \n\n水凝胶层与磺化CFRPEEK 之间的附着力由 Revetest 划痕测试仪确定。安装在划痕测试仪上的声发射（AE）传感器能捕捉水凝胶层产生裂纹时的声音，可用于检测划痕过程中裂纹的产生。利用划痕测试仪上的划痕自动全景成像装置观察划痕形态。具体如下：  \n\n设置仪器模式为渐进加载模式，划痕长度设置为 $5\\mathrm{mm}$ ，法向力设置为从 1N线性增加到 $100\\mathrm{N}$ ，划痕速率设为 $2\\mathrm{{mm}/\\mathrm{{min}}}$ ，采样频率为 $30\\mathrm{Hz}$ ；将 MACS 样品放入仪器中，金刚石压头在设定的法向力(Fn)和划痕速率下对 MACS 表面进行划刻，以获得声发射信号；由仪器自带的全景成像装置拍摄划痕的形貌；对获得的声发射信号和划痕形貌进行分析。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 105,
        "chunk": "# 4.2.7 表面 zeta 电势测试  \n\n不同 CFRPEEK 样品表面的 zeta 电势是用固体表面 Zeta 电位分析仪测定的。将不同的CFRPEEK 样品裁切成 $35\\times15\\times1.5~\\mathrm{mm}^{3}$ 大小，以 $0.001\\mathrm{~M~}$ 氯化钾  \n\n（KCl）溶液作为流动电解液，电解液的 $\\mathsf{p H}$ 使用 $0.1\\mathrm{~M~HCl}$ 和 $0.1\\mathrm{~M~NaOH}$ 溶液进行调整，范围为5.0-8.0，探究样品表面的 zeta 电位和pH 的关系曲线。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 106,
        "chunk": "# 4.2.8 蛋白吸附能力测试  \n\n将不同样品浸泡在 $0.5~\\mathrm{mL}$ 的 $0.5~\\mathrm{mg/mL}$ 牛血清白蛋白（BSA）溶液中，在规定的时间间隔内，收集BCA 溶液并用新鲜的溶液替换。使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定收集到的BCA 溶液的浓度，并进一步计算出不同样品的 BSA 蛋白的吸附量。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 107,
        "chunk": "# $4.2.9\\mathrm{Ca}^{2+}$ 、 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 和GA 在不同 $\\mathsf{p H}$ 下的缓释行为测试  \n\n将HAP 和 MGH 两组样品分别浸没到 $2\\mathrm{mL}$ 的 $\\mathrm{pH}{=}5.5$ 、6.5 和 7.4 的 PBS 溶液中，置于恒温 $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 、转速为 $100\\mathrm{rpm}$ 的摇床；在 1、3、5、7、14、21 天吸出缓释液并重新加入 $2{\\mathrm{~mL~}}$ 的新鲜的 PBS 溶液；用电感耦合等离子体光谱仪测定$\\mathrm{Ca}^{2+}$ 和 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 的缓释效率，用紫外分光光度计测定 GA 的缓释效率。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 108,
        "chunk": "# 4.2.10 体外矿化行为研究  \n\nSCP，MACS，HAP 和 MGH 的体外矿化研究的实验步骤与第二章相同，详见2.2.7 体外矿化行为研究。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 109,
        "chunk": "# 4.2.11 细胞实验",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 110,
        "chunk": "# 4.2.11.1 细胞的培养  \n\n细胞实验使用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7），研究改性CFRPEEK 的抗炎能力；采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），研究改性 CFRPEEK的成血管能力；采用大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC），研究改性 CFRPEEK 的成骨能力。大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的提取培养与传代实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.1。RAW264.7 和 HUVEC 都购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。RAW264.7、HUVEC 和 BMSC 都在 DMEM 完全培养基中常规培养。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 111,
        "chunk": "# 4.2.11.2 体外炎症反应测试  \n\n1. 采用流式细胞术检测不同样品的体外巨噬细胞极化情况。具体如下：（1）将处在对数生长期的 RAW264.7 细胞首先用 $1~\\mathrm{mL}$ 含 $100~\\mathrm{{ng/mL}}$ 脂多  \n糖（LPS）的 DMEM 培养基孵育 24 小时，再用常规培养基制成密度为 $1\\times10^{5}$   \ncell/mL 细胞悬液；（2）将经过Cobalt 60 灭菌的样品放入48 孔培养板中，用PBS 清洗一遍后，  \n每孔滴加 $1\\mathrm{mL}$ 上述细胞悬液；（3）细胞在培养箱培养 1 天后，弃去原始培养基，细胞通过胰蛋白酶消化  \n收集，用含 $1\\%$ BSA 的 PBS 洗涤细胞两次；（4）使用含有 $1\\%$ BSA 的 PBS 把细胞制成 $1{\\times}10^{7}\\mathrm{cell/mL}$ 的细胞悬液，取  \n$100~\\upmu\\mathrm{L}$ 细胞悬液置于EP 管中待用；（5）按照说明书的推荐用量加入荧光标记的抗体（FITC 抗小鼠 CD206 抗  \n体和PE 抗iNOS 抗体），混匀后置于 $4^{\\circ}\\mathrm{C}$ ，避光孵育30 分钟， $300\\mathrm{g}$ 离心5 分钟，  \n弃掉上清液；（6）在 $0.2~\\mathrm{mL}$ 含 $1\\%$ BSA 的 PBS 中重悬细胞，通过流式细胞仪检测和分  \n析。2. 不同样品上巨噬细胞分泌的炎症因子通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测  \n定。具体如下：（1）（2）和上述流式细胞术检测 RAW264.7 细胞极化实验步骤相同；（3）培养3 天后，收集培养基， $300\\mathrm{g}$ 离心培养基5 分钟，取上清液；（4）按照IL-10/ TNF-α酶联免疫试剂盒的说明书将上述收集的上清液制备  \n成反应液（5）在 $450\\mathrm{nm}$ 波长下测定各样品反应液的 OD 值；（6）建立标准曲线，通过标准曲线计算出样品中 IL-10/ TNF-α的浓度。3. 通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）研究RAW264.7 细胞在 LPS  \n刺激后在不同样品表面的炎症相关基因的表达情况，具体实验步骤与第二章相同，  \n详见 2.2.8.3 的实验 3。其中 RT-PCR 所需的炎性相关基因的引物对，如 Table 4.3  \n\n所示。  \n\nTable 4.3 Primer pairs to measure inflammation-related genes in RT-PCR.   \n\n\n<html><body><table><tr><td>Genes</td><td>Sequence (5'-3')</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>F: GACTTCCATCCAGTTGCCTT R: ATGTGTAATTAAGCCTCCGACT</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>F: GAAGACAATAACTGCACCCACT</td></tr><tr><td rowspan=\"2\">iNOS</td><td>R: AGTCGGTTAGCAGTATGTTGT</td></tr><tr><td>F: CCTTTGCTCATGACATCGACCA R: TCCTGCCCACTGAGTTCGT</td></tr><tr><td rowspan=\"2\">CD206</td><td>F: GTCATACCGTGTTGAACCTCT</td></tr><tr><td>R: ACACAATCATTCCGTTCACCAG</td></tr><tr><td rowspan=\"2\">GAPDH</td><td></td></tr><tr><td>F: GAACATCATCCCTGCATCCACT R: GATCCACGACGGACACATTGG</td></tr></table></body></html>  \n\n4. 用活性氧检测试剂盒来检测不同 CFRPEEK 样品上 RAW264.7 细胞的活性氧水平。具体操作方法如下：  \n\n（1）在 DMEM 完全培养基中将处于对数生长期的 RAW264.7 细胞制成细胞，密度为 $5{\\times}10^{4}~\\mathrm{cell/mL}$ ；  \n\n（2）将经过Cobalt 60 灭菌的样品放入48 孔培养板中，用PBS 清洗一遍后，每孔滴加 $1\\mathrm{mL}$ 上述细胞悬液；  \n\n（3）培养 $24\\mathrm{h}$ 后，用含有 $100\\mathrm{ng/mL}$ 脂多糖（LPS）的 DMEM 替换原培养基；  \n\n（4）继续培养 $24\\mathrm{~h~}$ 后，收集细胞，用无血清 DMEM 培养基配制的 $10~\\upmu\\mathrm{M}$ 二氯荧光素-二乙酸酯（DCFH-DA）溶液重悬细胞， $37^{\\circ}\\mathrm{C}$ 孵育 20 分钟后；  \n\n（5）洗涤 3 次，去除残留的 DCFH-DA，用 $0.5~\\mathrm{mL}$ 无血清 DMEM 培养基重悬细胞，荧光显微镜下观察并拍照。  \n\n5. 采用一氧化氮检测（NO）试剂盒检测不同 CFRPEEK 样品上 RAW264.7细胞中的一氧化氮的水平。具体如下：  \n\n（1）（2）（3）和上述RAW264.7 细胞活性氧检测实验步骤相同。（4）继续孵育 $24\\mathrm{h}$ 后，取培养基， $300\\mathrm{g}$ 离心 $5\\mathrm{min}$ ，收集上清液；（5）用 Griess 试剂 I 和 II 依次处理上述上清液，在 $540~\\mathrm{nm}$ 波长处测定各  \n\n孔的OD 值以探究 NO 水平。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 112,
        "chunk": "# 4.2.11.3 体外成血管性能测试  \n\n1. Cell Counting Kit（CCK-8）试剂盒检测 HUVEC 细胞在材料表面的增殖情况，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.2 的实验1。  \n2. 通过扫描电镜观察 HUVEC 细胞在材料表面的生长情况，具体实验步骤与第二章相同，详见2.2.8.2 的实验 2。  \n3. HUVEC 细胞在不同样品上的粘附与扩散用罗丹明标记的鬼笔环肽和DAPI 染色法进行检测，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.2 的实验3。  \n4. 通过Transwell 实验研究 HUVEC 细胞在不同样品上的迁移性能，具体的实验步骤与第三章相同，详见 3.2.8.2 的实验4。  \n5. 利用基质胶 Matrigel 研究 HUVEC 细胞在不同样品上的血管样网络结构的生成，具体的实验步骤与第三章相同，详见 3.2.8.4 的实验 4。  \n6. 通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）研究 HUVEC 细胞在不同样品表面的成血管相关基因的表达情况的具体实验步骤与第二章相同，详见  \n2.2.8.3 的实验 3。其中 RT-PCR 所需的成血管相关基因的引物对，如 Table 4.4。Table 4.4 Primer pairs to measure angiogenesis-related genes in RT-PCR.  \n\n<html><body><table><tr><td>Genes</td><td>Sequence (5'-3')</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>F: AGTGGTGAAGTTCATGGATGT</td></tr><tr><td></td><td>R: GGATGGCTTGAAGATGTACTCGA</td></tr><tr><td>HIF-1α</td><td>F: TCACCACAGGACAGTACAGGA</td></tr><tr><td></td><td>R: CGTGCTGAATAATACCACTCACA</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>F: CTCTGACTTCAACAGCGACACC R: TCCACCACCCTGTTGCTGTA</td></tr></table></body></html>",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 113,
        "chunk": "# 4.2.11.4 体外成骨性能测试  \n\n1. BMSC 细胞在材料表面的增殖情况通过 CCK-8 试剂盒测定，具体实验步骤与第二章相同，详见2.2.8.2 的实验1。  \n\n2. 通过扫描电镜观察 BMSC 细胞在材料表面的生长情况，具体实验步骤与第二章相同，详见2.2.8.2 的实验 2。3. BMSC 细胞在不同样品上的粘附与扩散用罗丹明标记的鬼笔环肽和 DAPI染色法进行检测，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.2 的实验34. 通过 Transwell 实验研究 BMSC 细胞在不同样品上的迁移性能，具体的实验步骤与第三章相同，详见 3.2.8.2 的实验4。5. 通过碱性磷酸酶（ALP）活性定量和染色实验检测 BMSC 细胞在不同样品表面的早期成骨分化情况，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.3 的实验1。6. 通过茜素红（ARS）染色和定量分析检测 BMSC 细胞在不同样品表面的晚期成骨分化情况，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.3 的实验2。7. 通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）研究BMSC 细胞在不同样品表面的成骨相关基因的表达情况，具体实验步骤与第二章相同，详见 2.2.8.3 的实验3，其中RT-PCR 所需的成骨相关基因的引物对详见Table 3.3。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 114,
        "chunk": "# 4.2.12 体内动物实验  \n\n动物实验采用大鼠皮下植入模型研究 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 植入物的体内抗炎和成血管能力。采用兔胫骨缺损模型来探究 MOF 水凝胶修饰的磺化CFRPEEK 植入物的体内成骨能力。所有动物实验程序均已通过吉林大学基础医学学院动物福利与伦理委员会批准（批准号：2021268），并按照相关机构指南和法律进行。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 115,
        "chunk": "# 4.2.12.1 大鼠皮下植入实验  \n\n1. 大鼠皮下植入模型的建立：将 12 只购买自北京维通利华的雄性 SD 大鼠（8 周，体重 $200{\\pm}25\\mathrm{g}$ ）随机分为四组：SCP，MACS，HAP 和MGH。所有动物均用异氟烷麻醉，起效后在大鼠背部备皮、消毒、铺巾并使大鼠呈俯卧位，在大鼠背部做一个 $1{-}2~\\mathrm{cm}$ 的纵向伤口，并在伤口的相对两侧建立两个皮下袋，随机植入两个样品并缝合。大鼠在 3 天和 5 天被安乐死，收集样品周围的皮肤组织，将组织样本固定在 $4\\%$ 多聚甲醛中以进行后续分析。  \n\n2.不同样品周围皮肤组织的成血管和炎症情况：将组织样本从固定液取出并拍照，以观察新血管的生成情况。组织样本包埋在石蜡中，蜡块放入石蜡切片机中，并切成为 $4~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 厚的切片。通过 CD31 免疫荧光染色对切片进行染色，进一步研究不同样品对新血管生成的影响。通过苏木精-伊红（H & E）染色法对切片进行染色，以检测样品周围皮肤组织的炎症情况。通过 CD86/CD163 免疫荧光染色对切片进行染色，以研究不同样品的体内抗炎能力。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 116,
        "chunk": "# 4.2.12.2 建立兔胫骨缺损模型  \n\n1.兔胫骨缺损模型的建立：将购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司雄性日本大耳白兔24 只（体重 $2\\mathrm{kg}$ ），随机分为 4 组：SCP，MACS，HAP 和 MGH。所有动物均用 Zoletil 50 $(5\\mathrm{mg/kg)}$ 和速眠新 $(0.2\\mathrm{mL}/\\mathrm{kg})$ 肌肉注射麻醉，起效后在兔的右后肢的胫骨区备皮、消毒、铺巾，作 1cm 纵切口，切开皮肤，钝性剥离皮下组织，露出胫骨。用 $5\\mathrm{mm}$ 外径的去骨钻在胫骨制造圆形骨缺损，将植入物随机植入缺损部位，用手术线缝合。在左侧后胫骨，进行相同的手术。实验动物每天肌肉注射一次抗生素，连续三天，以避免感染。兔在 4 周和 8 周被安乐死，收集含有样品的胫骨和内脏（心、肝、脾、肺和肾），固定在 $4\\%$ 多聚甲醛中以进行后续分析。 Figure 4.2 是兔胫骨缺损建立的示意图。  \n\n![](images/052ee10f263bcf59391338a34048550cfb6afa2aa29fd1c20a16b89f97e2872b.jpg)  \nFigure 4.2 Diagram of the rabbit tibial bone defect model.  \n\n2. 显微计算机断层扫描  \n\n具体操作步骤与第二章相同，详见2.2.9.2 显微计算机断层扫描 （micro-CT）  \n\n3. 组织学探究  \n\n（1）胫骨硬组织切片及染色  \n具体操作步骤与第二章相同，详见 2.2.9.3 实验1。（2）内脏石蜡切片及染色  \n具体操作步骤与第二章相同，详见 2.2.9.3 实验2。  \n\n4. 通过推出实验研究不同样品与骨组织的结合力。Figure 4.3 为推出实验的示意图。在 $23^{\\circ}\\mathrm{C}$ 和 $50\\%$ 相对湿度下，使用 AGX 电子万能材料试验机进行测量。将含不同样品的胫骨置于实验台上，施加轴向压缩应力，并以 $5.0\\ \\mathrm{mm/min}$ 的速度将样品推出，记录载荷-位移曲线和最大载荷情况。为了进一步观察新生骨的状况，对推出的不同CFRPEEK 植入物进行了SEM 和EDS 测试。  \n\n![](images/786d8e1063ed7637b5e4b2221fcc5c554e8a0cdf41b02ea77105bfef27bc4c57.jpg)  \nFigure 4.3 Schematic diagram of the push-out experiment.",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 117,
        "chunk": "# 4.2.13 统计与分析  \n\nIBM SPSS Statistics 22 软件用于数据的统计分析。统计显著性（ $(p<0.05$ ）是通过Tukey 事后检验的单因素方差分析（ANOVA）得出的。",
        "category": " Materials and methods"
    },
    {
        "id": 118,
        "chunk": "# 4.3 结果与讨论  \n\n4.3.1 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的制备  \n\nFigure 4.4 是 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的 SEM（a）和 TEM（b）图像，HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒呈针棒状。通过 Figure 4.4b 可以观察到 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒具有核壳结构，经过测量得出 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒长度为 $132.08\\pm41.18\\mathrm{{nm}}$ ，壳厚为 $6.02\\pm0.97\\mathrm{nm}$ 。HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的核壳结构能够控制生物分子 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 、GA 和 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放。  \n\n![](images/3b896d577412bb62ba441e5ebfc4d2c37372a2cb7da6c0e623cbadb03fed179c.jpg)  \nFigure 4.4 (a) SEM (scale bars $=100\\mathrm{nm}$ and $200\\mathrm{nm}$ ) and (b) TEM (scale bars $=25$ nm and $50\\mathrm{nm}$ ) images of HAP $@$ Mg-GA MOF nanoparticles.  \n\nFigure 4.5a 是纳米羟基磷灰石和 $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA}$ 的 XRD 谱图。XRD 结果表明，HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的衍射峰与纳米羟基磷灰石颗粒的标准峰（JCPDS 09-0432）匹配良好，说明 $\\mathbf{Mg-GA}$ 的壳层对羟基磷灰石核层的晶体结构没有影响。Figure 4.5b 是 HAP@Mg-GA 的 XPS 谱图。在 $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA}$ 上除检测到了 Ca 2p 和 P 2p 峰外，还检测到了 C 1s、O 1s、 $\\mathrm{Mg2p}$ 峰，这表明 Mg-GA成功沉积到纳米羟基磷灰石上。上述实验结果证明，我们成功制备了 $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-}$ GA MOF 纳米颗粒。  \n\n![](images/62660be7b41dfa61b8a08dd31eeea44a040ff4ae3c14f99f8a8d6e806e065696.jpg)  \nFigure 4.5 (a) XRD spectra of hydroxyapatite and HAP@Mg-GA nanoparticles. (b) XPS analysis of HAP $@$ Mg-GA MOF nanoparticles.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 119,
        "chunk": "# 4.3.2 甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）的制备  \n\nFigure 4.6 为 CSMA 的合成原理图及壳聚糖改性前后的 $\\mathrm{^{1}H N M R}$ 谱图。从壳聚糖的 $\\mathrm{{}^{1}H\\ N M R}$ 谱图中，可以观察到在 $1.9\\ \\mathrm{ppm}$ 处出现了壳聚糖乙酰化部分的峰， $3.0{-}3.8\\mathrm{ppm}$ 处则代表壳聚糖中的葡萄糖胺环。在 CSMA 的 $\\mathrm{^{1}H N M R}$ 谱图中，除了检测到上述壳聚糖的峰外，还在 $5.6\\mathrm{ppm}$ 和 $6.0\\mathrm{ppm}$ 处检测到亚甲基和甲基丙烯酰胺峰，表明壳聚糖改性成功。通过计算得出甲基丙烯酰胺的含量为壳聚糖上葡萄糖胺环的 $36\\%$ 。  \n\n![](images/78c248f6b23ebc40c749d108e9f5c303384a383e8d30d4d3ee6035891983bde5.jpg)  \nFigure 4.6 Schematic diagram of the synthesis of methacryloyl chitosan and $^{1}\\mathrm{HNMR}$ spectra of chitosan and methacryloyl chitosan.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 120,
        "chunk": "# 4.3.3 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的制备  \n\n将 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒与 CSMA 的凝胶前体溶液混合，通过紫外线照射接枝到磺化CFRPEEK 植入物的表面。接枝后，磺化的 CFRPEEK 的表面变成淡黄色。采用 SEM 分析了不同 CFRPEEK 的表面形貌，如图 Figure 4.7a 所示，在 SCP 表面观察到少量的裸露碳纤维和 3D 多孔网络结构。在紫外接枝后，3D 多孔结构和裸露的碳纤维被水凝胶覆盖。与 MACS 相比，HAP 和MGH 的表面不平整且纳米颗粒均匀分散在磺化 CFRPEEK 表面的水凝胶内。Figure 4.7b 为MACS 切片的横截面 SEM 图像，磺化 CFRPEEK 表面上的水凝胶厚度约为 22μm。  \n\n![](images/bcc3b8561285bed7eb5dfc184aa770365182e4da2635db45dc6adeeef13e0124.jpg)  \nFigure 4.7 (a) SEM images of different elements for SCP, MACS, HAP and MGH， scale bars ${\\bf\\mu}=1{\\bf\\mu}{\\bf m}$ and $5\\upmu\\mathrm{m}$ . (b) The cross-sectional image of MACS, scale bar $=50$ μm.  \n\nFigure 4.8 是不同 CFRPEEK 的表面 EDS 面谱（a）和元素的相对浓度（b）的分析结果。如Figure 4.8a 所示，在 SCP 表面观察到大量的碳和氧元素，还有由于磺化处理残留的少量硫元素。甲基丙烯酰化壳聚糖的紫外接枝使得 MACS、HAP 和MGH 中检测出了氮元素，除此之外，MGH 中还含有钙、磷和少量的镁（Figure 4.8b），这表明 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒成功的掺入到水凝胶中，实现了最初的设计目标。  \n\n![](images/2ecd3c774d52336eccd5a50f2b13301b52dc2ffe02ba38a51e94625c5c55c679.jpg)  \nFigure 4.8 (a) EDS maps of different elements for SCP, MACS, HAP and MGH. (b) EDS-determined atomic percentages SCP, MACS, HAP and MGH.  \n\nATR-FTIR 光谱显示了不同 CFRPEEK 样品上化学基团的变化。如 Figure 4.9所示，在 MACS, HAP 和 MGH 谱图中的 $2922\\mathrm{cm}^{-1}$ 处观察到了-CH3 的伸缩振动吸收峰。 $1642~\\mathrm{cm^{-1}}$ , $1542~\\mathrm{cm^{-1}}$ , $1320\\mathrm{cm}^{-1}$ 依次为酰胺Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ的峰，这表明甲基丙烯酰化壳聚糖已成功接枝到磺化 CFRPEEK 上[345, 346]。在 MGH 谱图中的 1030$\\mathrm{cm^{-1}}$ 处检测到了 $\\mathrm{PO}_{4}{}^{3\\cdot}$ -的伸缩振动吸收峰，表明了 MOF 纳米颗粒的成功掺入。  \n\nEDS 和 ATR-FTIR 实验结果表明，在磺化的 CFRPEEK 表面成功制备了 MOF 水凝胶层。  \n\n![](images/d09ee684b08447fb72ad41846bcdde6b4fc0b91aee02f0296ffe002bf2a704b0.jpg)  \nFigure 4.9 ATR-FTIR spectra of SCP, MACS, HAP and MGH.  \n\n为了进一步证明 MOF 水凝胶层的成功构建，通过水接触角检测了不同CFRPEEK 样品的表面亲水性。如 Figure 4.10 所示，SCP 的水接触角为 $116.3\\pm$ $1.3^{\\circ}$ ，表明SCP 的表面是疏水的。经过紫外接枝改性后，其他三组的水接触角显著降低，MACS 为 $63.6\\pm1.5^{\\circ}$ ，HAP 为 $57.1\\pm2^{\\circ}$ ，MGH 为 $42.2\\pm3.7^{\\circ}$ 。以前的文献研究表明，亲水表面可以促进成骨细胞的原始粘附[347]。  \n\n![](images/21f415eece191e7253bedcdf8fdbe2f3ee25e7f4c46ed429256826050a53c13b.jpg)  \nFigure 4.10 Water contact angles of SCP, MACS, HAP and MGH. \\*, & and # represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.  \n\nMOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的制备原理图如 Figure 4.1b 所示，经磺化处理的CFRPEEK 具有多孔的结构。当磺化处理的 CFRPEEK 在紫外线(UV)照射下，CFRPEEK 复合材料中的 PEEK 的二苯甲酮单元可以产生自由基，光引发聚合物甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA）的烯基双键可以与 PEEK 形成 C-C 共价键，从而诱导接下来的接枝聚合，CFRPEEK 表面就会形成 CSMA 水凝胶层。HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒会与 CSMA 形成氢键，从而增加了凝胶结构的稳定性。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 121,
        "chunk": "# 4.3.4 MOF 水凝胶层的附着力  \n\nMOF 水凝胶层与磺化 CFRPEEK 之间的附着强度采用划痕法测定。Figure4.11 为渐进加载条件下MACS 的划痕形态和AE 信号曲线。当 Fn 分别为 $3.96\\mathrm{N}$ 和7.12 N 时出现了第一和第二个 AE 信号，结合相应的划痕形态，水凝胶层并没有被完全破坏。因此，它们并不能代表水凝胶层与磺化 CFRPEEK 之间的粘附强度。当Fn 为 $10.98\\mathrm{N}$ 时出现了第三个 AE 信号，划痕形态表明在此力下 MOF 水凝胶层被完全破坏。因此，水凝胶层与磺化 CFRPEEK 之间的附着强度为 10.98N。  \n\n![](images/6427d19b413db5d72e4c7c6b61a0b2329f7988215a8b67c260e3de9976aeda87.jpg)  \nFigure 4.11 Scratch morphology and AE signal curve of MACS under progressive loading.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 122,
        "chunk": "# 4.3.5 表面 zeta 电势  \n\n不同CFRPEEK 样品的表面电荷情况通过表面 zeta 电势测定。结果如 Figure4.12 所示，在 $\\mathfrak{p H}$ 为 5-8 范围内，随着 $\\mathsf{p H}$ 的升高，所有样品表面的 zeta 电势减弱，zeta 电势的顺序为 $\\mathrm{MGH}>\\mathrm{MACS}>\\mathrm{HAP}>\\mathrm{SCP}$ 。由于甲基丙烯酰化壳聚糖是一种带正电荷的阳离子聚合物[348]，MGH、MACS 和 HAP 比 SCP 具有更高的zeta 电势。在氯化钾溶液中，纳米羟基磷灰石的 zeta 电势为负值[349]，所以HAP的 zeta 电势有所降低。由于在 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒中存在 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ ，MGH  \n\n的zeta 电势增加。  \n\n![](images/2ca2fa95d91277ef5866a04c4e2dab87a2538952c274a285b91c82bb558f64fd.jpg)  \nFigure 4.12 Zeta potential of SCP, MACS, HAP and MGH.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 123,
        "chunk": "# 4.3.6 蛋白吸附能力  \n\n以牛血清白蛋白（BSA）为参考蛋白，研究了各组样品的蛋白质吸附能力。如Figure 4.13 所示，各组的蛋白质吸附量随着培养时间的延长呈增加趋势。SCP在孵育 $^{4\\mathrm{~h~}}$ 后基本不能再吸附 BSA。各组的蛋白质吸附能力为 $\\mathrm{MGH}>\\mathrm{HAP}>$ $\\mathbf{MACS}>\\mathbf{SCP}$ ，与表面电荷的结果一致。在成骨整合的早期阶段，植入物在植入后最初识别的是蛋白质、纤维、离子、细胞因子以及血液环境中的其他成分[350]。能够立即识别并结合蛋白质到植入物表面是植入物骨整合的关键特征。正常人血液中的大部分蛋白质都带负电荷，即使在成骨细胞表面也是如此[351]。带负电荷的蛋白会因为静电相互作用而迅速粘附在带正电荷的植入物表面，从而极大提高植入物的生物相容性。根据上述实验结果，MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 具有良好的蛋白质吸附能力。  \n\n![](images/1ea7030d334985c4694efc16283da7b6afd699fec8061a79b0e546de6533aa5f.jpg)  \nFigure 4.13 Protein adsorption capacity of different samples within 4 days.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 124,
        "chunk": "# $4.3.7\\mathrm{Ca}^{2+}$ 、 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 和GA 的在不同 $\\mathsf{p H}$ 下的缓释行为  \n\n磺化 CFRPEEK 表面的 $\\mathsf{p H}$ 响应性水凝胶中的甲基丙烯酰化壳聚糖和HAP@Mg-GA 在生理液体中会发生降解，从而导致生物相容性的羟基磷灰石、没食子酸（GA）和镁离子的释放。ICP-OES 和UV-vis 用于测量 21 天内不同 $\\mathsf{p H}$ 值（5.5、6.5 和 7.4）下 HAP 和 MGH 中 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 、 $\\mathrm{Mg}^{2+}.$ 和 GA 的释放量。HAP 和MGH 的生物分子释放行为如 Figure 4.14a-c 所示。Figure 4.14a 是不同 $\\mathsf{p H}$ 下$\\mathrm{Mg}^{2+}$ 在MGH 中的释放曲线。在正常 $\\mathsf{p H}$ （ $\\mathsf{p H}=7.4$ ）条件下，MGH 中 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 的释放率明显低于弱酸（ $\\mathrm{\\pH}=5.5$ 和 6.5）环境下的。在初始阶段（第一天） $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 的释放出现了突释现象，这是由于靠近水凝胶表层的 $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA}$ 释放 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 引起的。随着时间的增加，弱酸环境会削弱甲基丙烯酰化壳聚糖的氢键，使得甲基丙烯酰化壳聚糖逐渐膨胀和降解，从而导致生物分子逐渐释放[352]。GA 在MGH 中的释放曲线与 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 相似（Figure 4.14b），这些结果表明弱酸环境有利于水凝胶层中 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 和 GA 的释放。 $\\mathsf{p H}$ 响应性 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 能够在炎症反应阶段（弱酸环境）释放足够的 GA 和 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ ，为骨整合初始阶段的炎症调节和血管生成提供更好的微环境。如 Figure 4.14c 所示，由于 $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-GA}$ 壳层的存在，MGH 中 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放效率比 HAP 低，并且在正常 $\\mathfrak{p H}$ （ $\\mathrm{\\Phi}_{\\mathrm{pH}}=7.4\\$ ）下$\\mathrm{Ca}^{2+}$ 能够长期且缓慢的释放，这为骨整合后期生成新骨提供了良好的微环境。上述实验结果符合预期，即 $\\mathsf{p H}$ 响应性 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 能够持续释放 GA 和 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ ，并在炎症环境（低 $\\mathfrak{p H}$ ）下调节炎症反应和促进新血管生成，而 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的长期释放能够促进骨整合后期（正常 $\\mathfrak{p H}$ ）新骨的生成。  \n\n![](images/d7839471842f678c2e8037b5bb9690f0bdac184dd9280e3df51e2c42b839c5ad.jpg)  \nFigure 4.14 The efficiency of released (a) $\\mathrm{Mg}^{2+}$ and (b) GA from MGH over time in the presence of PBS at $\\mathrm{pH}7.4$ , 6.5, and 5.5. (c) The efficiency of released $\\mathrm{Ca}^{2+}$ from HAP and MGH at various pH values (7.4, 6.5 and 5.5).",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 125,
        "chunk": "# 4.3.8 体外矿化行为  \n\n将不同CFRPEEK 样品浸入模拟体液（SBF）中研究它们生成骨样磷灰石的能力。Figure 4.15 为不同样品在 SBF 中浸泡 7 天后的表面形态变化的SEM 图像（a）和 EDS 分析（b）。如 Figure 4.15a 所示，在 SCP 和 MACS 上的沉积物数量相对较少。在 HAP 和 MGH 中均观察到明显圆形结节，特别是 MGH 组，它几乎完全被致密和均匀的球形沉积物所覆盖。如 Figure 4.15b 所示，MGH 上的球形沉积物的组成与骨样磷灰石相似。纳米羟基磷灰石和没食子酸是 MGH 中HAP@Mg-GA 的成分，可以作为矿物沉积的成核剂或诱导模拟体液中的 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ ,OH-,和 $\\mathrm{PO}_{4}{}^{3-}$ 在 CFRPEEK 表面生成骨样磷灰石。MOF 水凝胶层增强了磺化CFRPEEK 生成骨样磷灰石的能力，表明其具有良好的体外骨结合能力。  \n\n![](images/b0e27760e32f619cd28a1abafa65f2fbedf5ba60660aed76c611be08febcd243.jpg)  \nFigure 4.15 (a) SEM images of different samples after 7 days in SBF, scale bar $=10$ $\\upmu\\mathrm{m}$ . (b) The EDS spectra of different specimens after soaking in SBF for 7 days.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 126,
        "chunk": "# 4.3.9 体外炎症反应  \n\n在骨整合的早期阶段，当宿主免疫细胞被吸引或分化到植入物界面时，免疫细胞介导的炎症反应立即开始[316]。巨噬细胞是在免疫调节中发挥关键作用的主要炎症细胞。M1 和M2 分别是具有促炎功能和抗炎功能的巨噬细胞[353]。将促炎性M1 及时、准确地转成抗炎性 M2 对于恢复正常体内平衡至关重要[354]。因此，在磺化CFRPEEK 表面设计和构建 $\\mathsf{p H}$ 响应生物分子递送系统来调节炎症微环境，如改善低 $\\mathfrak{p H}$ 、缺氧和高ROS 环境，这是提高宿主受损组织再生能力的有效方法[341]。虽然 GA 和 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 的释放速率在弱酸环境中较快，但是 GA 和 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 的持续释放仍然可以使 $\\mathsf{p H}$ 响应的MOF 水凝胶能够实现精确的免疫调节功能。  \n\n采用脂多糖（LPS）处理 RAW264.7 巨噬细胞以模拟低pH 炎症环境[355]，使用 LPS 处理的 RAW264.7 作为对照组进行流式细胞术分析，以研究磺化CFRPEEK 表面上的 $\\mathsf{p H}$ 响应性 MOF 水凝胶是否可以主动和准确地进行免疫调节。iNOS 为 M1 的标记物，CD206 为 M2 的标记物。如 Figure 4.16 所示，与对照相比，在培养一天后暴露于 MGH 的 RAW264.7 巨噬细胞中，iNOS 显著减少$(5.55~\\%)$ ），CD206 明显增加（ $1.16\\ \\%$ ），这表明在低 $\\mathfrak{p H}$ 炎症环境下 MGH 可降低 M1 巨噬细胞极化，促进 M2 巨噬细胞极化。在先前的研究中，GA 已被证明可以通过抑制多种信号通路来阻碍 M1 巨噬细胞的极化[356]。 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 可以通过TRPM7 离子通道进入巨噬细胞，促进 M1 向M2 巨噬细胞转化[335]。  \n\n![](images/9c357cbc351cfc1aff29d2966e41c2bbdf0a227967313cf4141b25bd717ac979.jpg)  \nFigure 4.16 (a) In vitro flow cytometry detection of macrophage polarization after 1 day of culture.  \n\n采用 RT-PCR 测定暴露于不同 CFRPEEK 的 RAW264.7 的基因表达水平，以进一步探索促炎基因（IL-6），M1 表面标记物（iNOS），抗炎基因（IL-10）和M2表面标记物（CD206）的表达情况。如 Figure 4.17a 所示，在培养 5 天后，与 SCP组相比，MGH 中 IL-6 表达减少了 $66.28\\%$ ，IL-10 表达增加了 $137.39\\%$ ，同时，M2 标记物 CD206 表达水平显著升高，这表明 MGH 可以大大减弱 LPS 诱导的炎症反应。ELISA 用于跟踪 M1 和M2 相关细胞外细胞因子的分泌，其中 TNF- $\\mathbf{\\nabla}\\cdot\\mathbf{a}$ 为促炎细胞因子，IL-10 为抗炎细胞因子。正如预测的那样，相对于 SCP，MGH中的 TNF- $\\mathbf{\\sigma}\\cdot\\mathbf{a}$ 的分泌减少了 $67.09\\%$ （Figure 4.17b），IL-10 的分泌增加了 $284.19\\%$ （Figure 4.17c），这与炎性基因表达结果一致。上述所有发现都证实了我们的假设，即磺化 CFRPEEK 表面的 $\\mathsf{p H}$ 响应 MOF 水凝胶可以通过释放 GA 和 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 来促进 M1/M2 巨噬细胞极化和减轻炎症反应，这有利于损伤组织的修复（Figure4.17d）。  \n\n![](images/86df4432239f5913007bb8d7e5ea7d09cda48c2a9ee11485947759bd73baf21f.jpg)  \n\nFigure 4.17 (a) Heat map indicating expression of M1 marker (iNOS) and pro  \ninflammatory gene (IL-6) and M2 marker (CD206) and anti-inflammatory gene (IL  \n10) detected by RT-PCR after 5 days of incubation. Secretion of (b) TNF- $\\mathfrak{a}$ and (c) IL  \n10 after incubation for 3 days. (d) Schematic illustration of the accurate and proactive immunomodulation properties of the stimuli-responsive MOF hydrogel-modified   \nsulfonated CFRPEEK implant. \\*, #, & and a represents $p<0.05$ when compared with SCP + LPS, MACS $^+$ LPS, HAP $+$ LPS and $\\mathrm{MGH+LPS}$ , respectively.  \n\n在炎症反应阶段，植入产生的炎症环境可能会使 ROS 不受控制的产生和持续的氧化应激，从而导致细胞凋亡并进一步引发不利于骨愈合的炎症反应[357]。适当的氧化应激会减少细胞凋亡，减轻炎症反应，有利于新骨生成。利用二DCFH-DA 荧光技术探究巨噬细胞内 ROS 的量，结果如 Figure 4.18a 所示。经过LPS 处理后，对照组细胞内 ROS 生成增多，MGH 抑制了过量的 ROS 产生。通过流式细胞术进一步分析细胞内 ROS 水平，结果如 Figure 4.18b 所示。与其他组相比，MGH 的曲线向左移动，这表明 MGH 具有优异的抗氧化作用。根据早期的研究，GA 可以清除细胞内过量的 ROS，减轻ROS 诱导的炎症反应[341]。因此，pH 响应性MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 可以通过释放 GA 来缓解巨噬细胞氧化应激，使其能够减轻炎症反应。  \n\n![](images/516465fde7e38ddbeed682606cb31b4899b01fa696c939d2720ff7fc861b999f.jpg)  \nFigure 4.18 The intracellular ROS fluorescence intensity of RAW264.7 cells treated with different samples is analyzed by (a) fluorescence microscopy and (b) flow cytometry, scale bar $=100\\upmu\\mathrm{m}$ .  \n\n有研究表明，LPS 诱导 RAW264.7 后，iNOS 的表达增加，大量生成 NO，导致生理功能障碍[358]。因此，适量的 NO 生成有利于调节生理稳态。在 LPS 刺激24 小时后，检测不同样品中 RAW264.7 的 NO 释放，结果如 Figure 4.19 所示。MGH 中的 NO 释放相较于 SCP 降低了 $52.45\\%$ ，表明 MGH 抑制了 LPS 诱导的NO 释放并减轻了炎症反应。  \n\n![](images/26e8cdfb68dd657bc0ac2ee5e1f7cad092206c501de9248ae72cff10ec46ff32.jpg)  \nFigure 4.19 Release levels of NO in various samples after $24\\mathrm{h}$ of LPS induction. \\*, #, & and a represents $p<0.05$ when compared with $\\mathrm{SCP+LPS}$ , $\\mathrm{MACS+LPS}$ , HAP + LPS and $\\mathrm{MGH+LPS}$ , respectively.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 127,
        "chunk": "# 4.3.10 体外成血管性能  \n\n当巨噬细胞发挥作用时，血管也会逐渐重塑。血管生成是骨折愈合和骨整合过程中新骨生成的关键[359, 360]。如果植入界面的血管化过程缓慢，不充足的氧气和营养缺失会致使细胞死亡。因此，植入后快速和持续的血管生成是植入物的基本功能。HUVEC 用于研究 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的细胞相容性和血管生成能力。Figure 4.20a 显示了在不同 CFRPEEK 上培养的 HUVEC 的形态。培养 1 天后，HUVEC 在所有样品的表面扩散。SCP 上的 HUVEC 细胞呈梭形，并且具有最小的丝状伪足，这表明 SCP 不利于 HUVEC 细胞的粘附。MGH 上的HUVEC 细胞的扩散面积最大，并且细胞之间已经相互连接，这说明 HUVEC 细胞的融合效果相较于其他组更好。Figure 4.20b 是不同 CFRPEEK 样品的 CLSM图像，细胞骨架用罗丹明标记的鬼笔环肽（红色）染色，进一步证实了扫描电镜的结果。与 SCP 相比，有更多的 HUVEC 细胞粘附和扩散到其他 CFRPEEK 样品上。特别是，在 MGH 上观察到更多、更成熟的 F-肌动蛋白，这要归因于MGH粗糙的表面、高表面电位和亲水性，这些特性有利于细胞的粘附[361]。  \n\n![](images/a1d8a082ee586aea00a8ae2d6011795609eb50010fff0aa5797623fb65986ebb.jpg)  \nFigure 4.20 HUVEC morphologies after culturing on different samples for $24\\mathrm{h}$ detected by (a) SEM (Cells are false-colored to green for easier visualization) and (b) CLSM (Red staining represents the cytoskeletal organization), scale bars ${\\it\\Delta\\phi}=5{\\it\\Psi}\\upmu\\mathrm{m}$ and  \n\nCCK-8 进一步证实了 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的 HUVEC 细胞相容性。如 Figure 4.21 所示，培养 1 天后，不同样品的细胞活力排序为 $\\mathrm{SCP}{<}\\mathrm{MACS}$ $<_{\\mathrm{HAP}}<_{\\mathrm{MGH}}$ 。当培养时间延长到 5 天时，每组样品的细胞活力显著增加，其中MGH 细胞活力相较于 SCP 增加了 $29.32\\%$ 。MGH 上的细胞存活率明显高于 HAP上，这是由于MGH向周围环境中持续释放 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ ，促进了细胞增殖和粘附[333, 334]，这些结果表明，MGH 具有较高水平的细胞生物相容性。  \n\n![](images/faec55bbee3e82c4c2acec3767a4d35ae8d091891de6ebb23e5b9899b9a4b1e4.jpg)  \nFigure 4.21 Cell proliferation of HUVECs after 1, 3 and 5 days seeding on different substrates. \\* represents $p<0.05$ when compared with SCP.  \n\n采用 Transwell 实验研究了 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 对 HUVEC 细胞迁移的影响。如 Figure 4.22a 所示，培养 24 小时后，SCP 中只有少量的 HUVEC细胞发生迁移。与 MACS 和 HAP 相比，在 MGH 中的 HUVEC 细胞在 24 小时后发生明显的迁移。Figure 4.22b 是细胞迁移的定量分析结果，MGH 中迁移的HUVEC 细胞数量相较于 SCP 增多了 $598.25\\%$ 。  \n\n![](images/ca0a8a0fb940dd16d38c5736fef90d9cd30e03c41abf2f9192f491cc23e02ebd.jpg)  \nFigure 4.22 (a) Images and (b) quantitative analysis of migrating HUVECs exposed to different samples after $24\\mathrm{h}$ of incubation, scale bar $=200\\upmu\\mathrm{m}$ . \\*, # and & represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.  \n\nFigure 4.23a 是体外管形成实验结果。体外管形成实验表明，MACS 和HAP比SCP 生成了更多的毛细管样管，值得注意的是，MGH 的管形成明显增加。通过Image J 统计了不同样品管的总分支长度和分支数，结果如Figure 4.23b 所示。  \n\n与SCP 组相比，MGH 管的总分支长度和分支数分别增加了 $88.44\\%$ 和 $81.82\\%$ 。  \n\n![](images/33bcc04b853d8715f02f5ab99c331e635a4ef933cc21be1fab1f8f4c10a3e1b6.jpg)  \nFigure 4.23 (a) Tube formation and (b) corresponding parameter analysis of HUVECs exposed to different samples for $6\\mathrm{{h}}$ , scale bar $=200\\ {\\upmu\\mathrm{m}}$ . \\*, # and & represents $p<$ 0.05 when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.  \n\n利用 RT-PCR 实验检测与血管生成相关基因（VEGF 和 HIF- $1\\upalpha$ ）的表达水平，以此来量化 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的血管生成能力。如 Figure 4.24所示，在 MGH 上培养的 HUVEC 细胞的 VEGF 和 HIF- $1\\upalpha$ 的表达水平最高，相较于 SCP 分别提高了 $75.76\\%$ 和 $287.15\\%$ ，这表明 MGH 中镁离子的释放可以显著刺激血管生成。镁已被证明可以通过 TRPM7 和 MagT1 离子通道改善血管内皮细胞的增殖、粘附和运动[362]，从而提高细胞骨架蛋白和相关基因的表达，并显着加速新血管的形成[334]。综上所述，MOF 水凝胶层可以通过释放镁离子显著提高CFRPEEK 的血管生成能力。  \n\n![](images/45fe83040e6f29d062647782de6f91a3dc5d0193c0d77f576bc28db12ea67a21.jpg)  \nFigure 4.24 Detection of relative expression of angiogenesis-related genes VEGF and  \n\nHIF- $1\\upalpha$ by RT-PCR after 3 days of incubation. \\*, # and $\\&$ represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 128,
        "chunk": "# 4.3.11 体外成骨性能  \n\n骨整合最终是通过成骨细胞在免疫调节和血管生成后在植入物表面沉积新骨来实现的。优异的成骨活性对于植入物的成功植入和长期稳定性至关重要。BMSC 细胞用于研究 pH 响应 MOF 水凝胶在磺化 CFRPEEK 表面的体外成骨特性。如Figure 4.25a 所示，通过 SEM 观察在不同样品上培养的 BMSC 细胞的形态。 培养一天后，在所有样品上观察到 BMSC 细胞是随机扩散的。在 SCP 上的BMSC 细胞和 HUVEC 细胞一样呈纺锤形，这表明 BMSC 细胞在 SCP 上的粘附性较差。相比之下，在MACS 上培养的BMSC 细胞具有突出的丝状伪足。HAP和 MGH 上的 BMSC 细胞的扩散区域更广泛，这是由于 HAP 和 MGH 中的纳米羟基磷灰石和HAP@Mg-GA 纳米颗粒为BMSC 细胞附着提供了更多的锚定位点[363]。Figure 4.25b 是不同 CFRPEEK 样品的 CLSM 图像。与 SCP，MACS 和 HAP相比，MGH 上的BMSC 细胞的粘附拉伸更好，产生了更多的 F-肌动蛋白，细胞之间相互连接，这证明MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 具有更好的 BMSC 细胞粘附和扩散特性。  \n\n![](images/4f8355d7e327aaa099c8de74bf11fe24985d4e2173c4123c3a7accffdab50072.jpg)  \n\nFigure 4.25 BMSC morphologies after culturing on different samples for $24\\mathrm{h}$   \ndetected by (a) SEM (Cells are false-colored to green for easier visualization) and (b)   \nCLSM (Red staining represents the cytoskeletal organization), scale bars $=10\\upmu\\mathrm{m}$ and $50\\upmu\\mathrm{m}.$  \n\nBMSC 的细胞增殖是新骨生成的基础。通过 CCK-8 检测了 BMSC 在各种底物上的增殖情况，如 Figure 4.26 所示，BMSC 细胞在各种底物上的增殖方式与HUVEC 相当，并且它们在 MGH 上的活力远大于其他三组，表明 MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 具有良好的 BMSC 细胞相容性。  \n\n![](images/1553029623ee382e4047d8ce3632aa2b705ecfecd202d80c8b6343742d48f44d.jpg)  \nFigure 4.26 Cell proliferation of BMSCs after 1, 4 and 7 days seeding on different substrates. \\* represents $p<0.05$ when compared with SCP.  \n\n通过迁移实验研究不同样品对 BMSC 细胞的趋化性，结果如 Figure 4.27a 所示。培养 24 小时后，在 SCP 和 MACS 中仅观察到少量迁移的 BMSC 细胞，在HAP 和 MGH 中视野几乎被迁移的 BMSC 细胞充满。Figure 4.27b 是定量分析结果，从定量结果可以看出，HAP 和 MGH 比其他两组迁移的 BMSC 细胞更多，其中 MGH 中迁移的 BMSC 细胞的数量是 SCP 的 14.54 倍，这是由于 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的长期缓慢释放，能够刺激BMSC 细胞的迁移。  \n\n![](images/c88602c4acf1d7b32ec8f3e84525a4cd222587e7603a24d992601ee693dda906.jpg)  \nFigure 4.27 (a) Images and (b) quantitative analysis of migrating BMSCs exposed to different samples after $24\\mathrm{h}$ of incubation, scale bar $=200~{\\upmu\\mathrm{m}}$ .  \n\n利用 ALP 活性、基质矿化和成骨相关基因表达来探究 BMSC 细胞在 MOF水凝胶修饰磺化CFRPEEK 上的成骨分化能力。为了验证各种底物的早期成骨分化潜力，采用ALP 染色和定量分析来测定在不同底物上培养的 BMSC 中的ALP活性。如 Figure 4.28a 所示，随着时间的推移，不同底物上的 ALP 活性显着增加，HAP 和 MGH 的 ALP 活性高于其他两组。在第 14 天，MGH 的 ALP 活性相较于SCP 提高了 $25.41\\%$ 。值得一提的是，MGH 比HAP 的ALP 活性更高，这是由于 MGH 中的纳米羟基磷灰石和 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ 的协同作用促进了 BMSC 细胞的早期分化。Figure 4.28b 是不同底物的 ALP 染色图像，在培养 14 天，在 MGH 上观察到紫黑色物质，并且MGH 的 ALP 染色比其他三组深，这说明 MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 促进了 BMSC 细胞的早期成骨分化。  \n\n![](images/df84b2ecaa5321414b40f77b208662d63ec75de876774e036e55fec231c91e70.jpg)  \nFigure 4.28 (a) ALP activity of various samples after osteogenic induction for 7 and 14 days. \\* and # represents $p<0.05$ when compared with SCP and MACS, respectively. (b) ALP staining of various samples, scale bar $=2{\\mathrm{~mm}}$ .  \n\n基质矿化是晚期成骨分化的标志，通过 ARS 染色研究BMSC 细胞在不同底物上的基质矿化，染色结果如 Figure 4.29a 所示。培养21 天后，在 SCP 上观察到一些钙结节。HAP 和 MGH 上沉积的钙结节更多，在MGH 中观察到的钙结节最多、最密集。半定量分析基质矿化的结果如 Figure 4.29b 所示，MGH 在21天的钙沉积最多，相较于 SCP 增加了 2.67 倍。ARS 染色结果与 ALP 活性结果一致，这表明磺化CFRPEEK 表面的 MOF 水凝胶可有效刺激 ALP 分泌和基质矿化。  \n\n![](images/fcc8cd638e82ac446031812bfeed966301ff89cabc0372e0b46636b3ad761e19.jpg)  \nFigure 4.29 (a) Alizarin Red staining (ARS) of various samples, scale bar $\\cdot=2\\mathrm{mm}$ . (b)  \n\nQuantitative analysis of ARS staining after osteogenic induction for 21 days. \\*, # and & represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.  \n\n利用 RT-PCR 研究 BMSC 细胞成骨相关基因（ALP，Col-I，BMP-2 和 Runx2）在各种样品上的表达水平，进而探究 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 的成骨分化特征。如 Figure 4.30 所示，所有成骨相关基因的表达水平都随着培养时间的增加而提高。在 14 天，与 SCP 相比，ALP，Col-I，BMP-2 和 Runx2 在 MGH 上的表达水平分别提高了 $58.62\\%$ 、 $173.98\\%$ 、 $141.59\\%$ 和 $121.68\\%$ 。这些结果证明，与单独的纳米羟基磷灰石相比， $\\mathrm{HAP}@\\mathrm{Mg-G}_{\\mathit{i}}$ A 纳米颗粒显著提高了CFRPEEK 的成骨分化能力。根据报道，羟基磷灰石具有细胞相容性，并通过提高成骨相关基因的表达水平来刺激BMSC 分化成成骨细胞[364]。镁离子可以促进 BMSC 细胞增殖，迁移和粘附，激活成骨信号通路，并提高成骨相关基因表达以促进成骨分化[365]。 因此，磺化 CFRPEEK 表面的 MOF 水凝胶可以增强 BMSC 的粘附、增殖和迁移，并促进成骨分化。  \n\n![](images/3fa5b965bd439f4ecb88c7ddc24ab723fd99820309fe3318c268d1e7f61da301.jpg)  \nFigure 4.30 Heat map showing the expression of osteogenesis-related genes of BMSCs after osteogenic induction for 7 and 14 days. \\*, # and & represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 129,
        "chunk": "# 4.3.12 体内炎症反应和血管生成性能  \n\n采用SD 大鼠皮下植入模型研究体内炎症反应和血管生成。在植入 3 和5 天后，取出植入物周围的皮下组织，利用 H & E 染色和免疫荧光染色观察植入物周围组织的炎症状态。Figure 4.31 是（a）H & E 染色结果图像及（b）纤维层的厚度统计图。在植入 3 天和 5 天后，所有植入物周围的皮下组织都产生了纤维层（黑色箭头）。在植入 3 天后，SCP 周围有致密的连续纤维层，厚度为$1203.32{\\pm}162.46\\upmu\\mathrm{m}$ 。MACS 和 HAP 周围的纤维层较薄，厚度分别为 $524.20{\\scriptstyle\\pm65.19}$ $\\upmu\\mathrm{m}$ 和 $460.34{\\pm}108.07~{\\upmu\\mathrm{m}}$ ，这表明 MACS 和HAP 在体内的炎症水平较低。MGH周围的纤维层最薄，厚度为 $330.36{\\pm}30.34~\\upmu\\mathrm{m}$ ，这表明 MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 植入物具有与体外抗炎结果一致的抗炎特性。与第 3 天相比，在第 5天所有植入物周围的纤维层变薄，MGH 周围的纤维层仍然最薄且厚度为$128.37{\\scriptstyle\\pm38.56\\ \\upmu\\mathrm{m}}.$ 。  \n\n![](images/0969e163a1bd00b48594b8b69480819be05fec64ed912893ec9a2fcb10a034c1.jpg)  \nFigure 4.31 (a) H & E staining of the subcutaneous tissue around different implants, scale bar $=500\\upmu\\mathrm{m}$ . (b) Quantitative analysis of fibrous layer thickness. \\*, # and & represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.  \n\n利用CD86（M1 表面标记物）或 CD163（M2 表面标记物）的免疫荧光染色表征植入物-宿主界面巨噬细胞的表型改变情况，结果如 Figure 4.32 所示。在植入 3 天后，SCP 周围的 M1 巨噬细胞（CD86）的数量上升，并随着植入时间的增加而下降。与其他三组相比，MGH 周围的 M2 巨噬细胞（CD163）水平显著升高。定量分析结果如 Figure 4.33 所示，在植入 3 天和 5 天后，MGH 的 M1 巨噬细胞与M2 巨噬细胞的比例相较于 SCP 分别降低了 $57.23\\%$ 和 $58.90\\%$ ，这表明pH 响应性MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 具有准确和及时的免疫调节特性。  \n\n![](images/a65149f64326606cadda14eed4f95c4a97cb9e1c18073d13ef2e7b59773ca5b2.jpg)  \nFigure 4.32 Immunofluorescence staining results of macrophages in the subcutaneous tissue around different implants 3 and 5 days after implantation: red (CD86, M1 marker), green (CD163, M2 marker) and blue (DAPI), scale bars $=200$ and $50~{\\upmu\\mathrm{m}}$ .  \n\n![](images/f91a37b211a10401a0b6d383dc325189aa9278e92e34c4282d20f5b15ac983ae.jpg)  \nFigure 4.33 The ratio of CD86-positive cells to CD163-positive cells in subcutaneous tissue around different implants. \\*, # and $\\&$ represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.  \n\n植入3 和5 天后，取出植入物周围的皮下组织，并在整个过程中跟踪血管的形成。如 Figure 4.34a 所示，在植入第 3 天后，MGH 周围生成的毛细血管数量高于SCP 周围的毛细血管。在植入第 5 天后，HAP 和MGH 的血管生成均升高，MGH 的血管生成仍然是最高的，这表明 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 植入物有利于血管网络重塑。通过免疫荧光 CD31（一种内皮细胞生物标记物）染色进一步研究体内新生血管。如 Figure 4.34b 所示，MGH 的CD31 阳性血管增加。定量分析显示，MGH 的新血管数量在植入5d 后明显高于其他三组（Figure 4.34c），其中 MGH 的 CD31 阳性血管数量相较于 SCP 增加了 1.30 倍，这表明 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 植入物促进了血管的生成。上述研究结果表明用 MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 植入物具有良好的体内抗炎和血管生成特性。  \n\n![](images/26e25440851c119ac22405fab79915be8a420a5149672e41236ab6d72900dab2.jpg)  \n\n(b)  \n\n![](images/81f1aa81deb5dd0567d9a030a7734c1c50847547b83e2a56acb832ccc547d42e.jpg)  \nFigure 4.34 (a) In vivo vascularization assessment, scale bar $=2{\\mathrm{~mm}}$ . (b)  \n\nImmunofluorescence staining of CD31 in the subcutaneous tissue around different implants 3 and 5 days after implantation, scale bars $=200$ and $50~{\\upmu\\mathrm{m}}$ . (c) Quantitative analysis of CD31 immunofluorescence staining. \\*, # and & represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 130,
        "chunk": "# 4.3.13 体内成骨整合性能  \n\n体外细胞研究结果表明，磺化 CFRPEEK 表面上的 MOF 水凝胶具有良好的骨结合特性（包括优异的抗炎、血管生成和成骨特性）。创建兔胫骨缺损模型，以验证 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 植入物的体内骨整合特性。在手术后 4周和8 周，将兔子进行安乐死，并收取含样品的胫骨进行组织形态学和生物力学检测。在植入4 周和8 周后，利用显微计算机断层扫描（micro-CT）重建植入物周围的新骨结构，以分析植入物的新骨生成能力和骨-植入物界面的结合。Figure4.35a 和 b 是 micro-CT 的 2D 和 3D 重建的图像。在植入 4 周和 8 周后可以观察到所有植入物与周围的骨组织有明显的融合，没有发生移位，这表明植入物的长期骨固定。Figure 4.36a 和 b 是植入物周围新生骨的 3D 重建图像。在植入 4 周后，所有植入物都被薄薄的新骨层包围。与其他组相比，MGH 被更均匀和高质量的新生骨组织包围，这说明了 MGH 能促进缺损处的早期成骨。当植入时间延长至8 周时，与其他组相比，MGH 周围的骨体积更大，骨组织更致密，表明 MGH在宏观水平上具有出色的体内成骨能力。Figure 4.36c 和d 是新骨组织的厚度图像和骨组织参数的定量分析结果，MGH 具有最厚的骨组织，并且在植入 8 周以后MGH中新生骨的BV / TV和Tb.Th相较于SCP分别提高了 $28.08\\%$ 和 $99.53\\%$ 。上述结果表明， pH 响应性 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 植入物周围的新生骨在组织形态学上优于其他组，并且具有优越的早期成骨能力和长期骨生成能力。  \n\n![](images/e833040c7479d2d8e6303e1a52c995ca15ab9afa04b04eb76e48ccb36c76d50b.jpg)  \nFigure 4.35 (a and b) Reconstructed images of micro-CT and cross resection 4 and 8  \n\nweeks after surgery.  \n\n![](images/3092c3730da2bb26043018228838aac6171e344e60a0319e03bade8794b684d3.jpg)  \nFigure 4.36 (a and b) The 3D reconstructed micro-CT images of newborn bone with  \n\nimplants and without implants at 4 and 8 weeks, yellow represents sample, purple represents newly regenerated bone, scale bar $=2{\\mathrm{mm}}$ . (c) Representative images of Tb.Th at  4 and 8 weeks. (d) Quantitative analysis of micro-CT data including BV/TV and Tb.Th. \\*, # and & represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.  \n\n通过组织学染色（H & E 和Masson 染色）进一步研究植入物和骨组织之间的整合。如 Figure 4.37 和 Figure 4.38 所示，在植入 4 周后，所有植入物周围都有一层薄薄的新生组织。在 SCP 植入界面观察到纤维组织（用红色箭头表示）。过度的免疫反应会导致持续性炎症，从而在植入物周围滋生纤维囊，并妨碍植入物的骨整合[316]。相比之下，MGH 周围的新生骨（用黑色箭头表示）与植入物直接接触。在 8 周时，所有植入物中的纤维囊减少，新生骨增多。MGH 植入物周围没有明显的纤维囊，并且与新生骨组织紧密结合，这表明 MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 植入物能够最大限度地减少免疫炎症反应并增强成骨性能，从而提高成骨固定能力。  \n\n![](images/e7ad246c1de3e4661e82311968963bbfcacae401457d550995b3e8206dac0322.jpg)  \nFigure 4.37 H & E staining and Masson staining at 4 weeks (Red arrows mark the fibrous capsule; Black arrows mark the direct contact between new bone and the implants), scale bars $=100$ and $20~\\upmu\\mathrm{m}$ .  \n\n![](images/f66deb1179861392c3afbdd72315c58d50583a5bb162c7c8c368af79d3f6d839.jpg)  \nFigure 4.38 H & E staining and Masson staining at 8 weeks (Red arrows mark the fibrous capsule; Black arrows mark the direct contact between new bone and the implants), scale bars $=100$ and $20~\\upmu\\mathrm{m}$ .  \n\n植入物与周围骨组织之间的稳定安全连接是骨植入物临床应用的关键要素之一[306, 366]。通过机械推出测试来研究不同植入物的骨-植入物接触强度。不同植入物在植入 8 周后的载荷-位移曲线以及植入 4 周和 8 周后的最大推出力（Fmax） 结果如 Figure 4.39a 和 $\\mathbf{b}$ 所示。正如预期的那样，MGH 的Fmax 值远高于 SCP、MACS 和 HAP 的值，在 4 周和 8 周时分别为 $61.00{\\scriptstyle\\pm2.00\\ \\mathrm{N}}$ 和$122.67{\\scriptstyle\\pm14.01\\mathrm{N}}$ ，相较于SCP 分别增加了1.61 倍和1.69 倍，这说明MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 植入物界面处的骨固定强度提高。  \n\n![](images/4cd509c9ff6447e38a36f5500238f167ca2420782e53cab02445675b5d7a692f.jpg)  \nFigure 4.39 (a) The load–displacement curves of different implants at 8 weeks. (b)  \n\nThe maximum push-out force (Fmax) of the implants at 4 and 8 weeks, \\*, # and & represents $p<0.05$ when compared with SCP, MACS and HAP, respectively.  \n\n通过SEM 和EDS 进一步分析附着在植入物上的新生骨组织。如 Figure 4.40所示，植入4 周后，所有植入物上都附着有新生骨组织。SCP 植入物上观察到多孔表面，表明覆盖其表面的骨组织很少。在 SCP 植入物的 EDS 面谱图上观察到少量Ca 和P 元素的沉积进一步证实了这一点，这也解释了为什么 SCP 更容易被推出。与其他三组相比，MGH 植入物周围的新骨生成更为广泛。当植入 8 周时，MGH 植入物的表面几乎完全被更规则，致密的新生骨组织覆盖，MGH 的Fmax增加。总的来说，上述所有数据都表明，MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 植入物能够促进其周围高质量、连续的新骨组织的生成，从而提升植入物的机械锚定和长期成骨固定能力。  \n\n![](images/774e1ffae20ac556c796b3edc0893a2075925cee04f09111a44590bdd31cae4b.jpg)  \nFigure 4.40 The attachment and growth of bone tissue on the implant surface at 4 and 8 weeks analyzed by SEM and EDS maps (Green arrows indicate the calcified tissues, blue arrows point to the collagen, and yellow asterisks also represent the calcified tissues), scale bar $=25$ and $5\\upmu\\mathrm{m}$ .  \n\n植入物的另一个重要问题是体内生物毒性。对于 MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 植入物，MOF 水凝胶层的降解产物，如 $\\mathrm{Mg^{2+}}$ ，会循环到宿主血液中，从而对宿主器官产生毒副作用。在植入后 8 周后，收集实验动物的主要器官（包括心，肝，脾脏，肺和肾）进行 H & E 染色。如Figure 4.41 所示，在主要器官中未见病理性改变，证明本章中使用的所有植入物都没有明显的生物毒性。  \n\n![](images/254392db5ddd8a1db9f104d063bc907a4f9380f67ca80be5115cee34a6b49882.jpg)  \nFigure 4.41 H & E staining of major organs 8 weeks after implantation, scale bar $\\O=$",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 131,
        "chunk": "# 4.4 本章小结  \n\n考虑到植入物在植入后不同骨整合阶段所需的抗炎、血管生成和成骨特性，本研究团队在磺化CFRPEEK 植入物表面上设计并成功构建了多功能 pH 响应的MOF 水凝胶层。  \n\n（1）通过纳米羟基磷灰石、镁离子、没食子酸之间的耦合以及配位作用，设计制备了 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒，并通过甲基丙烯酰化壳聚糖与磺化CFRPEEK 之间的紫外接枝作用在磺化 CFRPEEK 表面制备了负载 HAP@Mg-GAMOF 纳米颗粒的水凝胶层。该 pH 响应MOF 水凝胶层表现出出色的蛋白质吸附能力和pH 响应的生物分子释放能力，优异的亲水性和骨状磷灰石形成能力。  \n\n（2）高度生物相容性的 pH 响应MOF 水凝胶层能够缓慢释放 GA， $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 和$\\mathrm{Ca}^{2+}$ ，这为磺化CFRPEEK 植入物修复受损骨组织提供了有利的生理环境。体外抗炎实验结果表明，相较于SCP，在MGH 上促炎因子TNF- $\\mathbf{\\sigma}\\cdot\\mathbf{a}$ 分泌减少了 $67.09\\%$ ，抗炎因子IL-10 分泌增加了 $284.19\\%$ ，这说明水凝胶层可以释放足够的生物分子以减轻早期急性炎症反应，并在炎症环境刺激下创造有利于骨再生的骨免疫微环境。  \n\n（3）体外成血管实验表明，MGH 上形成的管的分支长度相较于 SCP 增长了 $81.82\\%$ 。MOF 水凝胶层释放的 $\\mathrm{Mg}^{2+}.$ 促进植入物周围的血管生成，为新的骨形成阶段提供足够的氧气和营养成分。  \n\n（4）体内动物实验表明，MGH 周围的新生骨的骨小梁厚度相较于 SCP 提高了 $99.53\\%$ ，这说明在骨结合晚期， $\\mathrm{Ga}^{2+}$ 的长期和持续释放确保了细胞外骨基质的钙化并促进新骨的形成。  \n\n考虑到骨结合的不同阶段，构建多功能刺激响应性骨植入物的策略在惰性医疗植入物的表面生物工程中具有巨大潜力，特别是满足多功能植入物的临床需求。",
        "category": " Results and discussion"
    },
    {
        "id": 132,
        "chunk": "# 第 5 章 结论与展望",
        "category": " Conclusions"
    },
    {
        "id": 133,
        "chunk": "# 5.1 结论  \n\n本论文对骨骼的构成与结构、骨缺损的修复过程、骨组织工程、碳纤维增强聚醚醚酮表面生物功能化研究现状以及水凝胶在骨组织工程中的应用等进行了概述。针对CFRPEEK 植入物的生物惰性和成骨整合能力差这一瓶颈问题，从骨缺损愈合所需要的生物功能（抗炎、成血管和成骨）的角度出发，结合临床对超过临界尺寸骨缺损植入物的需求，本论文通过磺化处理和紫外接枝等表面改性技术，将负载地塞米松的甲基丙烯酰化明胶-聚丙烯酰胺复合凝胶、氧化石墨烯-羟基磷灰石冷冻凝胶和金属有机框架水凝分别修饰 CFRPEEK，从而开发了三种具有多功能生物活性凝胶修饰 CFRPEEK 骨科植入物，用于满足骨愈合环境下所需的多种生物功能，拓宽了 CFPEEK 复合材料在生物医学领域中的应用范围，为其临床应用提供了新的研发思路和科学参考。通过对表面改性 CFRPEEK 植入物的理化性能、体外细胞反应和体内骨整合性能进行分析，得出了以下结论：  \n\n1.从骨愈合所需的的生物相容性和成骨能力的角度出发，设计制备了负载Dex 的复合凝胶修饰CFRPEEK 植入物，用于治疗超临界尺寸的骨缺损。采用磺化处理和紫外接枝的表面改性方法将负载Dex 的GelMA/PAAM 复合水凝胶接枝到 CFRPEEK 植入物上，构建出了具有三维凝胶网络表面的 CFRPEEK 植入物。形貌分析表明，CFRPEEK 表面上成功构建了复合水凝胶网络结构，并且厚度为$50\\upmu\\mathrm{m}$ 。GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 具有优异的亲水性，在 21 天内的 Dex释放效率为 $53\\%$ ，缓慢长期的 Dex 释放能力有利于 BMSC 细胞的成骨分化，并且它具有优异的体外矿化能力。体外细胞实验表明，BMSC 细胞在GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 上能够较好的增殖、粘附和扩散，具有良好的体外生物相容性。 ALP、ARS 和RT-PCR 证明了它具有优异的体外成骨性能。体内大鼠的颅骨缺损实验表明，GelMA/PAAM/Dex 修饰 CFRPEEK 植入物具有优异的体内成骨性能，并且能够促进骨缺损的愈合。  \n\n2. 骨骼是一个高度血管化的组织，在骨缺损愈合的过程中伴随着血管的重塑。如果在骨愈合过程中的血管生成不及时，会造成氧气和营养物质的供给不足，从而导致后期的成骨能力差。针对这种情况，设计制备了多功能 GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 植入物，用于提高 CFRPEEK 植入物的成血管和成骨能力。首先，通过原位键合的方法制备 GO-HAP 纳米复合材料。然后，采用磺化处理和基于自由基光聚合的冷冻凝胶方法将负载 GO-HAP 的冷冻凝胶接枝到CFRPEEK 植入物表面上，构建了具有 3D 海绵状大孔冷冻凝胶网络表面的CFRPEEK 植入物。该冷冻凝胶层主要由 GO-HAP 纳米复合材料和GelMA/PEGDA 组成。在 CFRPEEK 表面构建的 3D 海绵状大孔冷冻凝胶的孔径为 $100~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 左右，能够促进细胞的增殖、迁移和新血管的长入。冷冻凝胶层的厚度为 $45~{\\upmu\\mathrm{m}}$ 。细胞实验证明，该多功能植入物表面的 3D 海绵状大孔结构和 GO促进了 HUVEC 细胞的长入和迁移，增强了 CFRPEEK 植入物的体外成血管能力。GO-HAP 冷冻凝胶修饰CFRPEEK 植入物表面优异的亲水性和 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的受控释放有利于BMSC 细胞的增殖、粘附和成骨分化。大鼠颅骨缺损实验进一步表明，GO-HAP 冷冻凝胶修饰 CFRPEEK 植入物可以迅速诱导新骨生成和新血管生成，显著提高了CFRPEEK 植入物的成骨固定和骨重塑能力。  \n\n3. 骨缺损的愈合发生在良好的炎症、血管化和成骨分化的基础上。植入物在植入早期过度的炎症反应和不及时的血管化会影响后期新骨的生成。为此，设计制备了 pH 响应性 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 植入物，以增强 CFRPEEK在植入后的抗炎、血管化和成骨能力。通过纳米羟基磷灰石、GA 和 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 之间的配位和耦合作用制备了具有核壳结构的 HAP@Mg-GAMOF 纳米颗粒。然后通过磺化处理和紫外接枝的方法将负载 HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒的甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶接枝到磺化 CFRPEEK 植入物表面。甲基丙烯酰化壳聚糖具有pH 响应性，所以 MOF 水凝胶修饰 CFRPEEK 植入物可以随着骨缺损处生理环境pH 值的变化来控制HAP@Mg-GA MOF 纳米颗粒中GA、 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 和 $\\mathrm{Ca}^{2+}$ 的释放，从而提高CFRPEEK 植入物的抗炎、血管化和成骨分化能力。实验结果表明，pH响应MOF 水凝胶修饰磺化CFRPEEK 植入物表现出优异的蛋白质吸附能力和 $\\mathsf{p H}$ 敏感的生物分子释放能力，以及出色的亲水性和良好的骨状磷灰石形成能力。MOF 水凝胶层的厚度为 $22\\upmu\\mathrm{m}$ 。体外和体内实验结果表明，磺化 CFRPEEK 表面的MOF 水凝胶层可以释放足够的抗炎药 GA 和营养元素 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ ，减轻植入早期的炎症反应，并为接下来的新骨生成提供有利的骨免疫微环境。 $\\mathrm{Mg}^{2+}$ 还促进了植入物周围的血管重塑，为新骨的形成提供了足够的氧气和营养。 $\\mathrm{Ga}^{2+}$ 缓慢长期的释放促进了新骨的生成和植入物的骨整合。",
        "category": " Conclusions"
    },
    {
        "id": 134,
        "chunk": "# 5.2 展望  \n\n本论文通过表面改性设计制备了一系列多功能凝胶修饰 CFRPEEK 植入物，使CFRPEEK 植入物的骨整合能力得到了改善。然而，由于实验周期和实验条件的限制，有些科学问题仍需要进一步探究：  \n\n1. 虽然第 2 章中制备的负载 Dex 的复合凝胶层增强了 CFRPEEK 植入物的生物相容性和成骨能力，但是该凝胶层的骨缺损修复机理尚不明确，这还需要我们从生物分子信号传导角度进一步深入探讨。  \n\n2.  冷冻凝胶的孔结构影响细胞的粘附、增殖与迁移。关于 3D 海绵状大孔结构的设计，在第3 章中通过对 GelMA/PEDGA 的比例、反应温度、紫外接枝时间、后处理工艺等影响孔结构的因素进行了探讨，使得冷冻凝胶层的孔径约为$100\\upmu\\mathrm{m}$ ，但是冷冻凝胶层的孔结构（形状、孔间连通情况）还是不可控的。所以，在未来的研究中我们计划通过 3D 打印技术来调控孔结构，并通过细胞动力学来分析孔结构对细胞的粘附、增殖与迁移等的影响。  \n\n3. 骨整合主要包括巨噬细胞的免疫反应、内皮细胞的血管生成和成骨细胞的骨再生，每个阶段都可以通过一些共同的细胞间信号通路与其它阶段相互作用。对于第 4 章中制备的 MOF 水凝胶修饰磺化 CFRPEEK 植入物，本研究团队证明了它具有抗炎、成血管和成骨性能，但是各个阶段之间的协调机制还有待于在后续的研究中进一步探讨。  \n\n参考文献   \n[1] Qin D, Wang N, You X-G, et al. Collagen-based biocomposites inspired by bone hierarchical structures for advanced bone regeneration: ongoing research and perspectives [J]. Biomaterials Science, 2022, 10 (2): 318-353.   \n[2] Battafarano G, Rossi M, De Martino V, et al. Strategies for Bone Regeneration: From Graft to Tissue Engineering [J]. 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